沉默Keap1基因?qū)rf2相關(guān)基因表達(dá)的影響及在砷皮膚氧化應(yīng)激損傷中作用.pdf

1、目的：研究Keap1基因沉默對(duì)Nrf2相關(guān)基因表達(dá)在砷致皮膚細(xì)胞毒性中的作用，為砷致皮膚損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：1.慢病毒載體的構(gòu)建。依據(jù)Keap1基因序列構(gòu)建Keap1shRNA,采用BamH I，EcoR I雙酶切載體,T4ligase連接載體與目的基因，經(jīng)感受肽細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，平板挑菌培養(yǎng)，菌液測(cè)序。2.慢病毒包裝。陽(yáng)性質(zhì)粒大量抽提擴(kuò)增，共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，收集病毒上清，測(cè)定病毒滴度。3.構(gòu)建沉默Keap1的HaCaT細(xì)胞系

2、。不同的慢病毒載體（空載體、Keap1 shRNA1/2/3）分別感染HaCaT細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（MOI）為5，48小時(shí)后，1μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。4.穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定。培養(yǎng)上述經(jīng)過(guò)篩選獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，提RNA并定量，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測(cè)細(xì)胞中Keap1 mRNA表達(dá)水平。5.采用MTT還原法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，確定LC50及染毒濃度，染毒濃度分別為L(zhǎng)C50的1/100、1/50、1

3、/10。6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。7.RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2、Keap1、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表達(dá)水平。8.ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中GSH、HO-1、As3MT蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.慢病毒干擾載體構(gòu)建，經(jīng)基因測(cè)序，顯示與目的基因序列完全匹配。2.慢病毒滴度測(cè)試結(jié)果，為2×108TU/ml。3.建立的Keap1-KD穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中sh1最好，其基因的沉默效率為71％,作為

4、后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。4.混合砷染毒模型細(xì)胞48h的LC50為290.00μmol/L，染毒濃度分別為L(zhǎng)C50的1/100為2.90μmol/L，LC50的1/50為5.80μmol/L，LC50的1/10為29.00μmol/L。5.2.90μmol/L混合砷染毒促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡；隨染毒濃度增加（5.80μmol/L-29.00μmol/L）染毒時(shí)間（48h、72h)延長(zhǎng)增殖水平下降，凋亡率迅速上升。6.低劑量（2.90、5.80μ

5、mol/L）短時(shí)間（8h、24h）混合砷染毒促進(jìn)模型細(xì)胞中Nrf2、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)：高劑量（29μmol/L）長(zhǎng)時(shí)間（72h）混合砷染毒抑制模型細(xì)胞中各基因的表達(dá)，與對(duì)照組相比表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。7.低劑量（2.90、5.80μmol/L）短時(shí)間（24h、48h）混合砷染毒模型細(xì)胞能促進(jìn)As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達(dá)，隨染毒濃度（29

6、μmol/L）增加時(shí)間延長(zhǎng)（72h），As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達(dá)量有所下降，但仍遠(yuǎn)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.混合砷染毒能改變細(xì)胞中增殖與凋亡的比率，低劑量促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，高劑量抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2.混合砷染毒模型細(xì)胞，Nrf2高表達(dá)，隨著染毒時(shí)間延長(zhǎng)、染毒濃度增加基因有下調(diào)趨勢(shì)，但明顯高于未轉(zhuǎn)染組。3.混合砷染毒能使模型細(xì)胞中Bach1、MAPK/ERK、CBP