三氧化二砷對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞中KEAP1基因表達(dá)作用研究.pdf

1、背景和目的
　　前列腺癌是在男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前治療前列腺癌的主要方法有手術(shù)，激素拮抗治療，化療和放療。雖然大多數(shù)前列腺癌患者最初的雄激素去勢(shì)有效，但他們通常會(huì)在數(shù)月至數(shù)年后出現(xiàn)在雄激素非依賴(lài)性。雄激素非依賴(lài)性的前列腺癌的預(yù)后比較差，且多對(duì)化療和放射治療不敏感。目前激素非依賴(lài)型前列腺癌對(duì)放、化療抵抗的機(jī)制目前還不明確。因此了解腫瘤細(xì)胞如何產(chǎn)生耐藥及如何才能逆轉(zhuǎn)耐藥是急需解決的重要問(wèn)題。
　　近幾年來(lái)已

2、有多項(xiàng)試驗(yàn)證實(shí)KEAP1-NRF2-ARE信號(hào)通路與多重耐藥機(jī)制相關(guān)聯(lián)[1，2]，目前已經(jīng)在NSCL、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)KEAP1基因的突變，使表達(dá)相關(guān)蛋白下降且NRF2相關(guān)蛋白高表達(dá)[3，4]，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌DU145細(xì)胞中KEAP1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化而低表達(dá)[5，6]，前列腺癌PC3細(xì)胞中KEAP1基因高表達(dá)，所以本實(shí)驗(yàn)選擇PC3細(xì)胞做為陽(yáng)性對(duì)照[7]。我國(guó)學(xué)者將三氧化二砷用于治療

3、急性早幼粒細(xì)胞白血病取得顯著療效，引起了普遍關(guān)注;隨后證實(shí)其對(duì)實(shí)體瘤也能獲得同樣效果，同時(shí)三氧化二砷的去甲基化作用也有報(bào)道。本研究通過(guò)用不同濃度As2O3溶液對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制影響及對(duì)細(xì)胞中KEAP1基因表達(dá)的影響，初步探索As2O3對(duì)KEAP1基因可能的作用機(jī)制，從而為激素非依賴(lài)性前列腺癌的治療提供新的治療藥物。
　　材料和方法
　　1.雄激素非依賴(lài)性前列腺癌DU145細(xì)胞，用10％滅

4、活胎牛血清含雙抗的新鮮DMEM-H培養(yǎng)液在細(xì)胞培養(yǎng)箱中(T:37℃，5％CO2)常規(guī)培養(yǎng);PC-3細(xì)胞用含10％滅活胎牛血清的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。
　　2.應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同濃度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0μmol/L)的As2O3不同作用時(shí)間(24、48、72h)對(duì)DU145細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　3.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)不同濃度（0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L

5、）As2O3作用于各組DU145細(xì)胞72h后KEAP1基因mRNA表達(dá)情況。
　　4.應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)不同濃度組(0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)As2O3的作用激素非依賴(lài)性前列腺癌DU145細(xì)胞株72h后KEAP1蛋白表達(dá)的情況，PC3細(xì)胞組作為對(duì)照組。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組數(shù)據(jù)間采用非參數(shù)檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及方差分析進(jìn)行差異比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=

6、0.05。
　　結(jié)果
　　1.MTT結(jié)果顯示:隨著As2O3濃度的升高對(duì)DU145細(xì)胞抑制作用越明顯，在8.0μmol/L時(shí)抑制率最高;根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)抑制率的測(cè)定在72h時(shí)抑制率最高。因此As2O3對(duì)DU145細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。
　　2.RT-PCR結(jié)果顯示:在不含As2O3的處理組中，前列腺癌DU145細(xì)胞的KEAP1基因mRNA表達(dá)不明顯，經(jīng)As2O3處理72h后，KEAP1基因表達(dá)逐漸增

7、強(qiáng)，在2.0μmol/L時(shí)條帶亮度最大，表達(dá)最強(qiáng)。
　　3.Westernblot結(jié)果顯示:陰性對(duì)照組keap1蛋白未表達(dá);不同濃度As2O3處理人前列腺癌DU145細(xì)胞72h后，各濃度組KEAP1蛋白均出現(xiàn)表達(dá);2.0μmol/LAs2O3處理組與陽(yáng)性對(duì)照PC-3組顯示的KEAP1蛋白條帶最深。
　　結(jié)論
　　1.As2O3對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且隨著劑量的增大或時(shí)間的增長(zhǎng)抑制作用而逐漸增強(qiáng)，