SORAFENIB對前列腺癌DU145細胞影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：前列腺癌是西方國家最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居西歐國家男性惡性腫瘤的第二位，死亡率位于男性惡性腫瘤患者的首位。我國前列腺癌的發(fā)病率雖然遠低于西方國家，但是近年來我國前列腺癌的檢出率和發(fā)病率呈直線上升趨勢，己位居泌尿系腫瘤的第三位，甚至第二位。并且一半以上前列腺癌患者確診時已經(jīng)是所謂的局部進展性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌，失去根治性手術(shù)治療機會，只能采用雄激素阻斷為主的內(nèi)分泌綜合治療，多數(shù)患者會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆颓傲邢侔擃惽傲?/p>

2、腺癌對化療的應(yīng)答率低?？偟膩碚f，目前對該類患者的治療總體療效較差，雄激素依賴型前列腺癌向雄激素非依賴型前列腺癌的轉(zhuǎn)變，以及雄激素非依賴型前列腺癌的治療成為目前研究的焦點。 Sorafenib(Nexavar，Bayer-Onyx BAY 43-9006)是一種小分子雙芳香基碳酰胺，最初被認為是一種口服的抑制Raf激酶的小分子激酶抑制劑，隨后的研究表明Sorafenib能抑制VEGFR-2，VEGFR-3，PDGFR-b等多個生長

3、因子受體激酶，也能降低RET和BCL-2的表達，Sorafenib還能夠降低Mcl-1蛋白水平和eIF4E磷酸化水平，是一種多靶點抑制劑。系列體外和體內(nèi)實驗研究表明Sorafenib能抑制腎癌、黑色素瘤、肺癌、肝癌等多種腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。Sorafenib作為一種靶向作用于Raf激酶與血管生成的抑制劑，還被視為無耐藥性的新型抗癌藥物，并且可以逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)這些腫瘤細胞P糖蛋白(p-gp)介導(dǎo)的多藥耐藥(MDR)。目前的研究

4、認為前列腺癌雄激素依賴向雄激素非依賴的轉(zhuǎn)變及前列腺癌對化療的低應(yīng)答率均與前列腺癌的MDR現(xiàn)象有重要關(guān)系。 本課題采用光鏡和電鏡，流式細胞技術(shù)，MTT等技術(shù)從細胞水平觀察Sorafenib對體外培養(yǎng)的前列腺癌雄激素非依賴型細胞株DU145細胞增殖和凋亡的影響；用Western-blot法檢測DU145細胞增殖和凋亡的關(guān)鍵蛋白表達變化，初步探討Sorafenib體外抑制DU145細胞增殖、誘導(dǎo)DU145細胞凋亡的機制；用MTT技術(shù)觀

5、察DU145/ADM細胞增殖，以及RT-PCR和Western-blot的方法檢測MDR-1基因mRNA及其產(chǎn)物p-gp蛋白表達來評價Sorafenib對DU145/ADM細胞的MDR的逆轉(zhuǎn)作用。 第一部分 Sorafen-b抑制DU145細胞增殖及誘導(dǎo)DU145細胞凋亡的實驗研究 目的:觀察Sorafenib對雄激素非依賴型前列腺癌DU145細胞增殖、細胞周期及細胞凋亡的影響。 方法:以不同濃度的Sorafen

6、ib作用于體外培養(yǎng)的DU145細胞不同時間，用顯微鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化，MTT法觀察細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡變化。 結(jié)果:0.5、1、2、5、10、15、20μmol/L Sorafenib作用DU145細胞24h、48h、72h后對DU145細胞增殖均有抑制作用，除0.5μmol/L組作用24h與對照組無顯著差異外，其他各組之間均有顯著差異，抑制呈現(xiàn)時間和劑量依賴關(guān)系。Sorafeni

7、b能引起DU145細胞典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細胞體積縮小，細胞核固縮、裂解、核碎片及凋亡小體形成。0、2、5、7、10、15umol/L Sorafenib作用48h后，DU145細胞G1期細胞數(shù)比例分別為45.4％、51.7％、55.0％、63.7％、67.0％、74.7％，凋亡細胞率分別為0.28％、7.6％、11％、18.5％、23.2％、28.4％。 結(jié)論:Sorafenib能抑制體外培養(yǎng)的雄激素非依賴型前列腺癌DU14

8、5細胞增殖，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴關(guān)系；Sorafenib能阻滯DU145細胞于G1期，誘導(dǎo)DU145細胞凋亡，有劑量依賴關(guān)系。 第二部分Sorafenib抑制DU145細胞增殖及誘導(dǎo)DU145細胞凋亡的機制 目的:探討Sorafenib抑制雄激素非依賴型DU145細胞株細胞增殖、阻滯DU145細胞周期及誘導(dǎo)DU145細胞凋亡的機制。 方法:分別用5umol/L、10umol/L、15umol/L濃度的Sorafe

9、nib作用DU145細胞相應(yīng)時間后，用Western-blot方法檢測DU145細胞t-ERK、P-ERK、t-AKT、P-AKT、PTEN、BCL-2、cyclinD1蛋白的表達變化。 結(jié)果:Sorafenib作用2h后，DU145細胞t-ERK、t-AKT、P-AKT與對照組比較無變化，而p-ERK隨著Sorafenib作用劑量增加，磷酸化水平逐漸降低；Sorafenib作用24h后，t-ERK、t-AKT無變化，而p-ER

10、K、P-AKT隨著Sorafenib作用劑量增加磷酸化水平逐漸降低；Sorafenib作用24h后，隨著Sorafenib作用劑量增加，BCL-2、cyclinD1蛋白的表達逐漸減少，而PTEN蛋白表達逐漸增加。 結(jié)論:Sorafenib所致的p-ERK、p-AKT、BCL-2、cyclinD1表達下調(diào)，誘導(dǎo)PTEN表達上調(diào)可能是Sorafenib抑制雄激素非依賴型DU145細胞株細胞增殖、阻滯DU145細胞周期及誘導(dǎo)DU145

11、細胞凋亡的主要作用機制。 第三部分 Sorafenib對DU145/ADM細胞阿霉素化療敏感性影響的研究 目的:觀察Sorafenib對DU145/ADM(耐AMD的DU145細胞)細胞阿霉素化療敏感性的影響。 方法:用MTT法觀察Sorafenib和阿霉素合用對DU145細胞增殖的抑制作用；分別用MTT法檢測Sorafenib作用前后阿霉素對DU145/ADM增殖的抑制、RT-PCR法檢測Sorafenib作用

12、前后DU145/ADM細胞MDR-1基因mRNA的表達水平、Westem-blot法檢測Sorafenib作用前后DU145/ADM細胞p-gp的表達水平來觀察Sorafenib對DU145/ADM的MDR的逆轉(zhuǎn)作用。 結(jié)果:Sorafenib和阿霉素聯(lián)合用藥對DU145細胞增殖的抑制率高于Sorafenib和阿霉素分別單獨作用DU145細胞的抑制率；阿霉素對經(jīng)Sorafenib處理后的DU145/ADM的抑制率顯著高于Sora

13、fenib處理前的抑制率；經(jīng)Sorafenib處理后，DU145/ADM對阿霉素的敏感性是處理前的2.16倍；經(jīng)Sorafenib處理后，DU145細胞MDR-1基因mRNA及其產(chǎn)物p-gp的表達水平顯著下調(diào)。 結(jié)論:Sorafenib能有效逆轉(zhuǎn)p-gp介導(dǎo)雄激素非依賴型前列腺癌的MDR，其逆轉(zhuǎn)機制可能主要通過下調(diào)MDR-1基因mRNA水平和p-gp蛋白的表達，PTEN、BCL-2、Raf/MER/ERK信號通路可能參與了逆轉(zhuǎn)過