ATRA、EGF對(duì)人前列腺癌激素非依賴性Du145細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移表型的影響.pdf

1、本課題對(duì)一種已穩(wěn)定建株的激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞Dul~,5分別加入增殖誘導(dǎo)劑EGF和分化誘導(dǎo)劑ATRA前后從細(xì)胞水平和分子水平兩個(gè)層面分別進(jìn)行研究，探索分化和增殖誘導(dǎo)劑在前列腺癌增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡中的作用。為將來(lái)采用分化誘導(dǎo)法或凋亡促進(jìn)法治療激素非依賴性前列腺癌或預(yù)防前列腺癌的轉(zhuǎn)移提供一定的理論基礎(chǔ)。 全文分下列三個(gè)部分： 第一部分，ATRA、EGF對(duì)前列腺癌激素非依賴性細(xì)胞株Dul45細(xì)胞增殖的影響 本部分研究

2、Dul45細(xì)胞經(jīng)ATRA、EGF干預(yù)后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞周期的影響及其相應(yīng)的分子機(jī)理。同時(shí)也進(jìn)一步研究了EGF促進(jìn)細(xì)胞增殖的可能信號(hào)通路。結(jié)果如下： 1．MTT法檢測(cè)，ATRA使Dul45細(xì)胞的生長(zhǎng)速率減慢，，EGF使Dul45細(xì)胞的生長(zhǎng)速率加快。 2．流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：ATRA主要抑制G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)換而抑制細(xì)胞增殖，使G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少，而EGF的作用相反。3．ATRA組細(xì)胞、EGF組細(xì)胞與

3、對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞周期蛋白(cyclin)Dl、A和E及周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK2，CDK4的蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化；周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑(CKI)中p16，p21的表達(dá)也無(wú)明顯區(qū)別，4．ATRA可促進(jìn)p27的表達(dá)，與cyclinA／E-CDK2復(fù)合物相結(jié)合的p27的量也明顯上升，但p27的mRNA水平卻無(wú)明顯變化。EGF可抑制p27的表達(dá)，與cyclinA／E-CDK2復(fù)合物相結(jié)合的p27的量也明顯下降，但p27的mRNA

4、水平也無(wú)明顯變化。 5．ATRA處理組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，磷酸化的Rb下調(diào)，非磷酸化的Rb相應(yīng)增多。EGF處理組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，磷酸化的Rb上調(diào)，非磷酸化的Rb相應(yīng)減少。 6．PI-3K抑制劑LY294002不能消除EGF組細(xì)胞中p27的表達(dá)及Rb的磷酸化水平的差別，而MEK磷酸化的抑制劑PD98059則能消除這些差別，表明EGF由MEK-MAPK信號(hào)通路而非PI-3K-PKB通路調(diào)節(jié)p27的表達(dá)。 本部

5、分研究結(jié)果可以認(rèn)為：ATRA主要通過(guò)促進(jìn)p27的表達(dá)，使其對(duì)CDK2的抑制加強(qiáng)，引起CDK2活力減弱。抑制了Rb磷酸化及其DNA合成，從而使細(xì)胞停留在G1期。EGF主要通過(guò)抑制p27的表達(dá)，使其對(duì)CDK2的抑制減弱，引起CDK2活力增加?；罨腃DK2又使Rb磷酸化，最后磷酸化的Rb脫離與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，使后者轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，促進(jìn)DNA合成，從而使細(xì)胞由G1期通過(guò)限制點(diǎn)而向S期轉(zhuǎn)化。EGF促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用主要通過(guò)MEK/MAPK信

6、號(hào)通路向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)。 第二部分ATRA、EGF對(duì)前列腺癌激素非依賴性細(xì)胞株Dul45細(xì)胞凋亡的影響 本部分研究Dul45細(xì)胞經(jīng)ATRA、EGF干預(yù)后，ATRA、EGF調(diào)控Dul45細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，進(jìn)一步研究了ATRA、EGF對(duì)Dul45細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響。結(jié)果如下： 1．流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Dul45細(xì)胞對(duì)40pMATRA處理48h后，凋亡比例明顯升高，表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞峰(亞二倍體峰)的明顯出現(xiàn)及升

7、高，而用EGF處理組沒有明顯的凋亡峰。 2．A0染色后免疫熒光顯微鏡觀察顯示：ATRA處理組可出現(xiàn)明顯的凋亡小體。 3．磷酸化PKB-T308和Bad-S136的表達(dá)都是ATRAEGF組細(xì)胞，而抗凋亡的Bc卜2和Bc卜xL則下調(diào)，其變化趨勢(shì)與Bax相反。 5．EGF、ATRA處理Du

8、l45細(xì)胞中的p53，死亡受體凋亡通路中的Fas-L，F(xiàn)as的表達(dá)均無(wú)明顯改變。 6．經(jīng)ATRA處理后，Dul45細(xì)胞中被裂解后有活性的caspase-3片段顯著增多；EGF處理時(shí)，caspase-3的裂解產(chǎn)物極少，主要以無(wú)活性的酶原形式存在。 7．EGF組細(xì)胞中，細(xì)胞骨架蛋白一肌動(dòng)蛋白F—actin表現(xiàn)為排列較為整齊，清晰，邊緣完整。Dul45細(xì)胞在ATRA作用下，F(xiàn)—actin的正常的結(jié)構(gòu)被破壞呈稀疏、不規(guī)則、發(fā)散狀

9、排列，并且邊緣呈破損狀。。 從本部分的結(jié)果看來(lái)，ATRA作為一個(gè)凋亡誘導(dǎo)因子，主要通過(guò)抑制一些抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL)及PKB的活性，和促進(jìn)一些促凋亡蛋白(Bax、Bad)的表達(dá)。這些ATRA引起的抗凋亡蛋白的表達(dá)下調(diào)和促凋亡蛋白的表達(dá)增加活化了caspase-3，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，推斷^TRA可能主要通過(guò)線粒體途徑由caspase-3途徑介導(dǎo)，并導(dǎo)致細(xì)胞骨架的破壞從而誘導(dǎo)的Dul45細(xì)胞的凋亡。而EGF的作用相

10、反，抑制了細(xì)胞的凋亡。 第三部分ATRA、EGF對(duì)前列腺癌激素非依賴性細(xì)胞株Dul45細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型的影響 本部分研究Dul45細(xì)胞經(jīng)EGF,ATRA干預(yù)后，ATRA、EGF對(duì)Dul45細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型的影響及相關(guān)的分子機(jī)制，結(jié)果如下： 1．ATRA可抑制Dul45細(xì)胞對(duì)Fn的黏附能力；EGF可促進(jìn)Dui45細(xì)胞對(duì)纖連蛋白(Fn)的黏附能力。 2．ATRA可抑制Dul45細(xì)胞對(duì)HUVEC的黏附能力；EGF可促進(jìn)

11、Dul45細(xì)胞對(duì)-人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的黏附能力。 3．ATRA可抑制Dul45細(xì)胞的遷移和侵襲能力；EGF可促進(jìn)Dul45細(xì)胞的遷移力(Transwell法和劃痕法)。 4．ATRA可抑制Dul45細(xì)胞的侵襲能力；EGF可促進(jìn)Dul45細(xì)胞的侵襲能力(Transwell法)。 5．EGF處理使Dui45細(xì)胞中整聯(lián)蛋白α5βl中β1亞基蛋白的表達(dá)顯著增加(westernblot、流式細(xì)胞檢測(cè)法)，M

12、APK信號(hào)通路抑制劑PD98059可使Dul45細(xì)胞中整聯(lián)蛋白α5β1中β1亞基蛋白的表達(dá)下調(diào)。 6．EGF處理使Dui45細(xì)胞中整聯(lián)蛋白α5β1中βl亞基mRNA的表達(dá)上調(diào)；MAPK信號(hào)通路抑制劑PD98059可使Dul45細(xì)胞中整聯(lián)蛋白僅5β1中β1亞基mRNA的表達(dá)下調(diào)；(RT-PCR檢測(cè))。 從本部分的結(jié)果看來(lái)，ATRA處理使Dul45細(xì)胞粘附和遷移、侵襲能力增明顯降低，而EGF能促進(jìn)Dul45對(duì)Fn、HUVEC

13、的粘附能力和遷移、侵襲能力。Fn的主要受體是整聯(lián)蛋白α5β1，我們進(jìn)一步研究EGF的MAPK信號(hào)通路對(duì)Dul45細(xì)胞中整聯(lián)蛋白α5和βl表達(dá)的影響。細(xì)胞經(jīng)EGF及其EGF+MAPK信號(hào)通路抑制劑PD98059分別處理，流式細(xì)胞儀檢測(cè)及Western-blot檢測(cè)顯示整聯(lián)蛋白α5的表達(dá)沒有發(fā)生明顯改變，但EGF處理使整聯(lián)蛋白α5β1中β1亞基蛋白的表達(dá)顯著增加而EGF+MAPK信號(hào)通路抑制劑PD98059后可使Dul45細(xì)胞中整聯(lián)蛋白α5