雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞耐藥機(jī)制的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前列腺癌是歐美國家男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌，居男性腫瘤的第二位。美國癌癥學(xué)會估計(jì)，2009年美國大約有19.228萬名男性被診斷為前列腺癌，約有2.736萬前列腺癌患者死亡[1]。目前，我國前列腺癌發(fā)病率雖遠(yuǎn)低于西方國家，但近年來隨著人們生活方式的改變、壽命的延長及醫(yī)療保健和診斷水平的提高，我國前列腺癌發(fā)病率呈顯著增長趨勢，而且與西方國家前列腺癌發(fā)生有所不同，我國前列腺癌患者在初診時往往已為進(jìn)展期，喪失了手術(shù)良機(jī)，預(yù)后較

2、差，生存期也較短。雄激素去勢治療是除外科手術(shù)與放射治療外的標(biāo)準(zhǔn)前列腺癌治療方法，然而經(jīng)過中位數(shù)為18～24個月的緩解期后，雄激素依賴性前列腺癌（Androgen-Dependent Prostate Cancer，ADPC）轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔ˋndrogen-Independent ProstateCancer，AIPC），表現(xiàn)為前列腺癌細(xì)胞在緩解期過后又開始增殖，PSA進(jìn)行性升高，極易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)變后的治療非常棘手，死亡

3、率極高，前列腺癌已成為危害老年男性人群健康的重大疾病。
　　 對AIPC的轉(zhuǎn)變機(jī)制研究，是目前國內(nèi)外前列腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，主要涉及：雄激素受體（androgen receptor，AR）基因的擴(kuò)增；雄激素受體突變；凋亡調(diào)控基因的異常，由于前列腺癌的生物學(xué)行為極其復(fù)雜，以上理論并不能合理地闡述AIPC的發(fā)生機(jī)制，雄激素非依賴性前列腺癌發(fā)病仍需進(jìn)一步深入研究。
　　 建立一株能模擬臨床上前列腺癌由雄激素依賴轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且?/p>

4、賴過程的細(xì)胞模型，能模擬人前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、結(jié)局的生理病理全過程，能夠體現(xiàn)出人前列腺癌各階段的特點(diǎn)，能模擬人前列腺癌基因的改變和前列腺癌對治療的反應(yīng)。采用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)以及蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的研究手段，進(jìn)一步揭示雄激素依賴性前列腺癌向雄激素非依賴性前列腺癌轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生機(jī)制，有望為雄激素非依賴性前列腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。
　　 主要研究內(nèi)容：
　　 1.在去雄激素的培養(yǎng)環(huán)境和雄激素阻斷劑氟他胺作用下，

5、誘導(dǎo)前列腺癌LNCaP細(xì)胞向雄激素非依賴性轉(zhuǎn)化，建立雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系-LNCaP-AI細(xì)胞系和LNCaP-AI+F細(xì)胞系，鑒定雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系生物學(xué)特征變化。
　　 2.研究雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系-LNCaP-AI細(xì)胞系和LNCaP-AI+F細(xì)胞系的AR受體通路變化，包括目前AR受體突變分析、AR受體表達(dá)變化（mRNA和蛋白質(zhì)水平）；AR受體對雄激素反應(yīng)性以及PSAmRNA和PSA蛋白質(zhì)水平變化；細(xì)

6、胞信號通路主要信號蛋白變化。
　　 3.采用PCR、Western Blot和免疫組織化學(xué)染色方法檢測了RON基因表達(dá)情況，研究受體酪氨酸激酶RON在雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞向雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中作用。
　　 4.利用Solexa高通量測序技術(shù)分別對LNCaP和LNCaP-AI+F細(xì)胞系的小分子RaNA進(jìn)行測序，利用生物信息學(xué)技術(shù)對所得到的大規(guī)模序列進(jìn)行分析，篩選出與雄激素非依賴性前列腺癌相關(guān)的miRN

7、A，同時可能發(fā)現(xiàn)一些新的miRNA，最后對感興趣的miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測。
　　 主要結(jié)果：
　　 1.LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化：雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞轉(zhuǎn)化為雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞-LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系，其形態(tài)學(xué)發(fā)生了變化，表現(xiàn)為：細(xì)胞胞體變小，呈扁平狀，少見圓形或梭形，多見單個細(xì)胞獨(dú)立生長，同時出現(xiàn)聚集生長現(xiàn)象；而LNCaP細(xì)胞形態(tài)呈三角

8、形或長梭型，小部分為圓形，分布均勻。
　　 2.LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系細(xì)胞生長特性發(fā)生了變化：
　　 2.1在去雄激素環(huán)境下，LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系生長速度顯著高于LNCaP細(xì)胞；氟他胺對生長抑制作用明顯減弱.
　　 2.2 LNCaP-AI細(xì)胞系對雄激素的生長反應(yīng)性明顯下降，僅高濃度雄激素才刺激細(xì)胞增殖生長，而低濃度雄激素卻無增殖反應(yīng)性，但不同濃度雄激素對LNCaP-

9、AI+F細(xì)胞生長均無刺激作用，說明LNCaP-AI+F細(xì)胞和LNCaP-AI對雄激素反應(yīng)性也存在差異。
　　 2.3 LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系細(xì)胞侵襲能力和細(xì)胞遷移活性高于LNCaP細(xì)胞，特別是LNCaP-AI+F細(xì)胞系細(xì)胞遷移活性明顯高于LNCaP細(xì)胞。
　　 3.LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系細(xì)胞AR信號通路變化：
　　 3.1在雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞向雄激素非依賴性前列腺

10、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系細(xì)胞AR并沒有發(fā)生突變，但LNCaP-AI細(xì)胞AR表達(dá)上調(diào)，而LNCaP-AI+F細(xì)胞AR表達(dá)下調(diào)。
　　 3.2 PSA表達(dá)在LNCaP-AI和LNCaP細(xì)胞之間無差異（P>0.05），但在LNCaP-AI+F細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）；氟他胺、雙氫睪酮和十一酸睪酮均能刺激LNCaP、LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞表達(dá)和分泌PSA，但LNCaP-

11、AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞對雙氫睪酮和十一酸睪酮反應(yīng)性下降，特別是LNCaP-AI+F細(xì)胞對雙氫睪酮和十一酸睪酮刺激存在PSA轉(zhuǎn)錄和分泌反應(yīng)性和對藥物濃度敏感性下降。
　　 4.LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞受體酪氨酸激酶表達(dá)：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞的RONmRNA、RON蛋白質(zhì)均為陰性，說明RON基因在前列腺癌從雄激素依賴性向雄激素非依賴性轉(zhuǎn)變過程中不起作用。
　　 5.L

12、NCaP-AI+F細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜變化：
　　 5.1實(shí)驗(yàn)組LNCaP-AI+F細(xì)胞共檢測出376個miRNA，而對照組LNCaP細(xì)胞共檢測出357個miRNA。存在表達(dá)差異miRNAs有94個，其中48個表達(dá)上調(diào)，46個表達(dá)下調(diào)。
　　 5.2預(yù)測新miRNA共有15個，其中LNCaP-AI+F細(xì)胞有9個新miRNA，而LNCaP細(xì)胞有6個新miRNA。
　　 主要結(jié)論：
　　 1.建立了雄激素非

13、依賴性前列腺癌細(xì)胞系-LNCaP-AI和LNcaP-AI+F細(xì)胞系，其細(xì)胞生物學(xué)生長特性和對雄激素反應(yīng)性與LNCaP細(xì)胞之間存在明顯差異，為雄激素非依賴性前列腺癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了良好的細(xì)胞學(xué)模型。
　　 2.在LNCaP細(xì)胞系轉(zhuǎn)變?yōu)長NCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系過程中，AR均沒有發(fā)生突變，但LNCaP-AI細(xì)胞的AR表達(dá)上調(diào)，而LNCaP-AI+F細(xì)胞的AR表達(dá)呈下降趨勢；AR信號通路并沒有被阻斷，但對雄激素反

14、應(yīng)性下降。提示在長期的去雄激素環(huán)境和氟他胺抑制作用，LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞的AR通路存在差異，雖然AR信號通路還是有效地，但對雄激素反應(yīng)性下降。
　　 3.在LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系中RON基因均沒有表達(dá)，提示：RON基因在LNCaP-AI和LNCaP-AI+F細(xì)胞系從ADPC轉(zhuǎn)變?yōu)锳IPC過程中可能不起作用。
　　 4.在激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞和雄激素非依賴性前列腺癌L