人雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞Caveolin-1基因的表達(dá)及辛伐他汀的干預(yù)研究.pdf

1、前列腺癌為西方國(guó)家最常見的惡性腫瘤，居西方國(guó)家男性所有惡性腫瘤發(fā)病率的第二位，死亡率的首位。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前已位居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。前列腺癌從發(fā)生到臨床表現(xiàn)需要長(zhǎng)達(dá)十幾年甚至幾十年的時(shí)間。大量研究表明，正常前列腺組織發(fā)展為前列腺癌經(jīng)歷了前列腺上皮細(xì)胞內(nèi)瘤、局部前列腺癌、侵襲性前列腺癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌等階段。約2/3的前列腺癌患者就診時(shí)已是晚期，只能采用雄激素阻斷為主的綜合治療。阻斷雄激素能有效的緩解前列腺

2、癌癥狀，但12～18個(gè)月后，約1/3的病人前列腺癌會(huì)復(fù)發(fā)，并轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔?。目前，臨床上尚無有效的方法來治療雄激素非依賴性前列腺癌，因此對(duì)該類患者的治療已經(jīng)成為臨床關(guān)注的焦點(diǎn)之一。在雄激素依賴性前列腺癌細(xì)胞向雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中，有多種因子參與或介導(dǎo)。近年來研究表明，Caveolin-1不僅與維持膽固醇平衡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理功能密切相關(guān)外，而且在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多方面、多環(huán)節(jié)上發(fā)揮著關(guān)鍵的

3、調(diào)控作用。新近研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1在前列腺癌尤其是進(jìn)展期前列腺癌中呈高表達(dá)，可能參與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。 他汀類藥物，羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑，是目前臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化極為重要的一類調(diào)脂藥。最近的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物對(duì)人白血病細(xì)胞株HL-60、黑素瘤、纖維瘤、乳腺癌等多種細(xì)胞有明顯抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。但是，他汀類藥物能否抑制前列腺癌細(xì)胞尤其是雄激素非依賴性前列癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡

4、，以及是否通過Caveolin-1基因發(fā)生作用，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、Westernblot法檢測(cè)人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3和PC-3m細(xì)胞系中Caveolin-1mRNA及蛋白表達(dá)情況，初步探討Caveolin-1過表達(dá)是否與前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)；采用HMA-CoA還原酶抑制劑辛伐他汀觀察其對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖、凋亡及Caspase-9，8，3活性與Caveol

5、in-1表達(dá)的影響，探討辛伐他汀對(duì)人前列腺癌的作用及可能的分子機(jī)制，為臨床上前列腺癌的預(yù)防與治療提供新的理論與方法。 第一章 Caveolin-1在人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3和PC-3m細(xì)胞中的表達(dá)及意義。 目的：研究人前列腺癌PC-3和PC-3m細(xì)胞中Caveolin-1mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，分析Caveolin-1與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，探討Caveolin—1過表達(dá)在PC-3m具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性中的作用

6、，為雄激素非依賴性前列腺癌基因治療提供新靶點(diǎn)。 方法：以人前列腺癌PC-3和PC-3m細(xì)胞系為研究對(duì)象，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT—PCR)、Western blot法檢測(cè)Caveolin—lmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果： 1．人前列腺癌PC-3和PC--3m細(xì)胞中均有Caveolin-1mRNA的表達(dá)，PC-3m細(xì)胞中的Caveolin-1表達(dá)水平明顯高于PC-3細(xì)胞，兩者有顯著性差異(P<0．05

7、)。 2．人前列腺癌PC-3和PC-3m細(xì)胞中均有Caveolin-1蛋白質(zhì)表達(dá)，PC-3m細(xì)胞中Caveolin-1蛋白質(zhì)表達(dá)量較PC-3細(xì)胞增加，兩者有顯著性差異(P<0．05)。 結(jié)論： 1．PC-3、PC-3m細(xì)胞中存在Caveolin—ImRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)。 2．Caveolin-1過表達(dá)可能與人前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。 3．Caveolin-1可作為前列腺癌基因治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

8、 第二章辛伐他汀對(duì)人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞的作用研究。 目的：觀察辛伐他汀對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討辛伐他汀對(duì)人前列腺癌的作用及可能分子機(jī)制。 方法：四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)PC-3細(xì)胞的增殖； Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡法觀察PC-3細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，并計(jì)算凋亡核百分率；Annexin V-FITC/PI雙染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Caspase活性

9、定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)半胱天冬特異性蛋白酶-9，8，3(Caspase-9，8，3)的活性；RT-PCR及Western blot檢測(cè)Caveolin-1mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。 結(jié)果： 1.辛伐他汀可顯著抑制PC-3細(xì)胞的體外增殖，并呈濃度和時(shí)間依賴性(P<0.05)。 2.Hoechst 33258染色顯示PC-3細(xì)胞經(jīng)辛伐他汀(20μmol/L)分別處理24h和48h后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞體

10、積縮小，核固縮，鏡下細(xì)胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染。FACS檢測(cè)結(jié)果顯示，20μmol/L辛伐他汀處理12h、24h、48h后的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為14.81±1.08％、23.42±2.33％、40.77±4.06％。PC-3細(xì)胞分別經(jīng)10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀處理48h后，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，凋亡核百分率計(jì)數(shù)分別為(11.20±3.33)％，(31.20±3.08)％，(56.24±4.50)％。FA

11、CS檢測(cè)結(jié)果顯示，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀處理PC-3細(xì)胞48h后的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為17.26±1.44％、32.45±2.56％、60.47±3.98％。PC-3細(xì)胞經(jīng)辛伐他汀(20μmol/L、40μmol/L)處理12h后，Caspase-9，8，3的活性顯著增加。 3.RT-PCR及Western blot檢測(cè)顯示10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L辛伐他汀處理48h后