雄激素剝奪激活前列腺癌細胞PP1依賴的雄激素受體表達的研究.pdf

1、前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是歐美國家男性最常見的惡性腫瘤之一，占男性腫瘤相關死亡的第二位，已成為全世界男性主要的公共衛(wèi)生問題。在我國，隨著人們生活水平、健康意識的提高及醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，前列腺癌的檢出率呈逐年上升趨勢。早期(局限性)前列腺癌的治療以外科手術切除為主；晚期前列腺癌的治療則以內(nèi)分泌治療及聯(lián)合放化療為主，目前被廣泛認可的內(nèi)分泌治療為雄激素剝奪治療(Androgen deprivation therap

2、y，ADT)；ADT可以使90％的患者PSA水平維持在較低水平，起初絕大多數(shù)患者對其治療敏感，但是在治療后2-3年內(nèi)激素敏感型前列腺癌不可避免的進展為更具侵襲性的去勢抵抗型前列腺癌(Castration resistant prostate cancer，CRPC）。CRPC目前普遍的研究顯示：雄激素剝奪條件下，雄激素受體(Androgen receptor，AR)持續(xù)激活對于維持去勢條件下腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關重要。磷蛋白磷酸酶(Phos

3、pho-protein phosphatase，PPPs)正成為AR一個重要的調(diào)控因子，前期研究結果顯示：雄激素存在的條件下，蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase1，PP1)可以明顯刺激AR激活。目前我們的研究確定了(雄激素剝奪條件下)PP1依賴的AR表達及轉(zhuǎn)錄激活。在機制方面，闡明了PP1與AR相互作用主要由AR的配體結合域(Ligand binding domain，LBD)介導，該結構域也介導著AR主要的泛素化修飾

4、及其降解作用。PP1依賴的AR表達主要通過如下途徑實現(xiàn)：1，通過抑制LBD介導的泛素修飾及泛素K48方式連接的泛素級聯(lián)反應；2，通過對特異性降解AR的E3泛素連接酶(E3 ligase)脫磷酸化并使其失活，從而抑制其介導的AR降解。值得注意的是，雄激素誘導的A R N-C端相互作用可以顯著抑制PP1與AR相互關聯(lián)；而雄激素剝奪的條件下可以促進PP1依賴的AR表達。此外，雄激素可以減弱PP1與AR的相互作用，而臨床上應用的抗雄激素藥物能夠

5、逆轉(zhuǎn)這一效應，并且聯(lián)合PP1抑制對AR的失活有協(xié)同作用?？傊覀兊难芯拷沂玖擞蒔P1介導的促進AR表達的調(diào)控通路，這一通路可以補償雄激素缺失引起的AR表達降低，靶向PP1或PP1與AR相互作用復合體中關鍵因子，可能為C RP C治療提供新的理論依據(jù)。本研究分為三個部分進行闡述：
　　第一部分 PP1依賴的AR表達上調(diào)、轉(zhuǎn)錄激活及PP1與AR相互作用的機制
　　目的：探索雄激素剝奪條件下PP1對AR表達的影響；確定PP1與A

6、R相互作用的具體機制。
　　方法：構建質(zhì)粒HA-AR、Flag-PP1、ARE4-luciferase、pCMV-pRL-Renilla luciferase、Flag-vector、HA-vector，應用不同前列腺癌細胞(LNCaP/C4-2)，雄激素剝奪條件下，添加或不添加 PP1特異性抑制劑：互變霉素(Tauto myc in)、雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)處理，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報告

7、基因、實時定量PCR(qRT-PCR)、細胞增殖實驗(MTT)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB)實驗分析PP1對AR表達、A R調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄激活、細胞增殖的影響；N C BI數(shù)據(jù)庫查詢AR氨基酸序列并進行分析確定與 PP1相互結合的基序(K VFF)，構建質(zhì)粒 HA-AR-KAFA、Probasin-Luciferase、Flag-AR、Flag-AR-KAFA、HA-AR-DBD、HA-AR-DBD-KAFA，利用前列

8、腺癌細胞(PC3)、人腎上皮細胞(293T)、人宮頸癌細胞(Hela)及非洲綠猴腎細胞(Cos1)，通過在雄激素剝奪條件下添加或不添加 DHT處理，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報告基因、Western blot、Microcystin-IP、Co-IP實驗的方法,分析PP1與AR相互作用是否依賴該基序(KVFF)、KVFF突變?yōu)镵AFA對AR活性及兩者相互作用的影響；構建質(zhì)粒Flag-Sox9、HA-AR-NTD、HA-AR-NTD-DB

9、D、HA-AR-DBD-LBD、HA-AR-LBD、His-Ub，利用293T細胞，在雄激素剝奪條件下，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Ni(nickel)-NTA-IP、Co-IP、Western blot實驗分析PP1主要與AR哪個結構域相互作用及相應結構域的化學修飾。
　　結果：雄激素剝奪的條件下，PP1可以明顯穩(wěn)定AR表達、AR介導的基因轉(zhuǎn)錄激活、前列腺癌細胞的增殖，而在PP1特異性抑制后可以減弱對AR的上述影響，并且這種減弱效應可以通過

10、DHT劑量依賴性方式緩解；在PP1與AR相互關聯(lián)中，KVFF基序起著較弱的作用：該基序突變可以影響AR的活性及其介導的下游基因表達，但是不影響兩者的相互作用；通過對PP1與AR的不同結構域相互關聯(lián)的研究分析，確定PP1主要與AR中富含泛素化修飾的LBD相互作用。
　　結論：雄激素剝奪的環(huán)境中，維持AR信號通路激活需要增加PP1的表達，并且拮抗PP1可以提高前列腺癌細胞雄激素的敏感性；AR-KVFF基序在PP1與AR相互關聯(lián)中發(fā)揮的

11、作用較弱，PP1與AR相互作用可能通過其它的機制介導；PP1與AR相互作用主要通過AR的LBD介導，且該結構域富含泛素化修飾。
　　第二部分 PP1依賴的AR穩(wěn)定表達的機制研究
　　目的：探索PP1通過何種機制介導AR穩(wěn)定表達及其具體機制。
　　方法：構建質(zhì)粒Myc-his-Ub、Myc-his-Ub-K11R、Myc-his-Ub-K48R、Myc-his-Ub-K63R、HA-Ub、Flag-AR，通過前列腺癌細胞

12、(VCaP)、293T細胞、Hela細胞，在雄激素剝奪條件下，添加或不添加蛋白酶體抑制劑(MG132)、Ta uto myc in處理，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、IP、Ni(nickel)-NTA-IP、Co-IP、Western blot實驗分析PP1穩(wěn)定AR表達是否通過抑制AR的LBD介導的泛素降解和泛素K11、K48、K63方式連接的泛素修飾；應用質(zhì)粒HA-AR、Flag-PP1、HA-AR、HA-AR-NTD-DBD、HA-AR-LBD、

13、HA-vector、Flag-vector，利用人宮頸癌細胞(He la)，在雄激素剝奪條件下添加或不添加蛋白酶體抑制劑(MG132)、放線菌酮(Cycloheximide，CHX)、Tautomycin處理，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Western blot實驗分析PP1穩(wěn)定AR表達是否通過阻斷LBD介導的泛素-蛋白酶體降解通路；構建質(zhì)粒Flag-PP1-H248K、HA-AR-S650A、HA-MDM2、HA-SKP2、HA-MDM2-S16

14、6A、HA-SKP2-S72A在雄激素剝奪條件下，添加或不添加 DHT、Tautomycin處理，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Western blot實驗分析PP1穩(wěn)定AR是否通過脫去E3-泛素連接酶(E3 Ligases)磷酸基團使其失活，從而減少AR的降解。
　　結果：雄激素剝奪的條件下，PP1穩(wěn)定AR表達是通過阻斷AR的LBD介導的泛素-蛋白酶體降解，這種機制不同于MG132抑制蛋白酶體介導的蛋白降解機制：后者沒有干擾蛋白的泛素化修飾過

15、程，與PP1相關聯(lián)的單泛素、雙泛素、三泛素修飾的AR，很可能來源于夭折的多聚泛素級聯(lián)反應中的降解產(chǎn)物；不同的AR結構域相比較，PP1不能或很少穩(wěn)定AR-NTD-DBD結構域的表達，顯示出AR的NTD端不是PP1優(yōu)先結合的底物，所以PP1阻斷泛素-蛋白酶體依賴的AR降解主要通過LBD介導實現(xiàn)；對兩種E3-泛素連接酶的研究顯示：PP1穩(wěn)定AR表達是通過脫磷酸化與失活特異性E3-泛素連接酶，這些E3-泛素連接酶(MDM2/SKP2)可以介導A

16、R的泛素-蛋白酶體降解。
　　結論：雄激素剝奪的條件下，PP1穩(wěn)定AR表達，主要是通過阻斷AR的LBD介導的與泛素K48方式連接的泛素-蛋白酶體降解；PP1主要與AR的LBD相互關聯(lián)，PP1抑制泛素-蛋白酶體依賴的AR降解主要由AR的LBD介導；PP1穩(wěn)定AR表達是通過脫去特異性E3-泛素連接酶的磷酸基團并使其失活，從而減少AR降解。
　　第三部分雄激素與抗雄激素對PP1與AR相互作用影響的研究
　　目的：探索雄激素、

17、抗雄激素激素對PP1與AR相互作用及細胞功能的影響。
　　方法：構建質(zhì)粒 pBIND-AR-LBD、HA-AR-FxxAA，通過293T細胞，在雄激素剝奪條件下添加或不添加DHT處理，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Co-IP、Western blot，實驗分析雄激素存在的環(huán)境中DHT通過何種機制干擾PP1與AR及DHT對PP1與AR融合蛋白(pBIND-AR-LBD)、AR-FxxLF突變體(AR-FxxAA)的影響；構建質(zhì)粒 AR-W741C

18、、AR-F876L突變體，通過不同前列腺癌細胞(VCaP/ LNCaP/C4-2)、293T細胞、HeLa細胞，在雄激素剝奪條件下添加或不添加比卡魯胺(Bicalutamide)、恩雜魯胺(Enzalutamide)、米非司酮(Mifepristone)、醋酸環(huán)丙孕酮(Cyproterone acetate)、ARN509處理，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報告基因、qRT-PCR、MTT、IP、Co-IP、Western blo t實驗分

19、析抗雄激素對PP1與AR相互作用的影響、AR介導的下游基因的轉(zhuǎn)錄激活、細胞增殖的影響。
　　結果：雄激素剝奪的條件下，雄激素處理會引起PP1與AR相互作用的解離，明顯地降低PP1與AR、AR-BDB-LBD結構域的相互作用，但較小影響與AR-LBD結構域的相互作用，雄激素處理也對 PP1與 AR-FxxAA突變體相互作用影響較??；雄激素處理引起的PP1與AR相互作用的減弱，而這種變化可以通過添加比卡魯胺或恩雜魯胺處理逆轉(zhuǎn)；雄激素剝

20、奪的環(huán)境中，PP1可以顯著增加AR表達及其下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，這種影響并不被比卡魯胺或恩雜魯胺的處理所抑制，但后者可以有效地阻斷雄激素依賴的AR轉(zhuǎn)錄激活。在含有DHT的培養(yǎng)基中生長的LNCaP細胞，恩雜魯胺可以下調(diào)AR表達、轉(zhuǎn)錄激活及細胞增值，PP1抑制連同恩雜魯胺處理對抑制AR表達及前列腺癌細胞的增值有協(xié)同效應。
　　結論：雄激素剝奪的條件下，雄激素處理可以引起PP1與AR相互作用的解離，機制為DHT引起的AR構象改變(N-C端