KHDRBS家族對前列腺癌細胞表型及雄激素受體的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與抑癌基因突變、DNA修復基因失活及原癌基因異常激活密切相關，有多種信號通路參與?；虻倪x擇性剪接調控在前列腺癌中發(fā)揮重要作用，對于前列腺癌至關重要的雄激素受體（androgen receptor，AR）受剪接調控能夠產生多種異構體，其中AR-V7和AR-V567es參與前列腺癌耐受內分泌治療并進展為去勢抵抗前列腺癌的過程。研究發(fā)現(xiàn)RNA結合蛋白KHDRBS1能夠協(xié)助

2、剪接小體識別AR外顯子3b并完成剪接最終形成AR-V7，而且KHDRBS1異常促進包括前列腺癌在內的多種惡性腫瘤進展并與臨床分期、病理分級和患者預后等臨床指標正相關。KHDRBS1基因有兩個同源且高度保守的亞家族成員，KHDRBS2和3，二者與KHDRBS1在RNA結合功能域KH域有70％～80％的氨基酸序列一致，并且與KHDRBS1存在交互作用，同時與乳腺癌、腎癌等也有關聯(lián)。但KHDRBS2和3在前列腺癌中的作用研究仍屬空白。本課題中

3、對KHDRBS家族在PCa進展中的作用，特別是KHDRBS2和3對前列腺癌細胞的作用以及與AR及AR剪接異構體的關系進行相關探討，以增加對KHDRBS家族的認識，豐富前列腺癌發(fā)生進展的分子機制研究。
　　研究目的:
　　1.明確KHDRBS家族基因在前列腺癌細胞系中的表達水平;
　　2.明確KHDRBS2和3在前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及細胞周期中的作用;
　　3.明確KHDRBS2和3間的相互關系;
　

4、　4.明確KHDRBS家族與AR、AR-V7和AR-V567es的關系。
　　研究方法和結果:
　　一、KHDRBS家族在前列腺癌中的生物信息學分析及在前列腺癌細胞系中的表達驗證
　　方法:1）應用cBioPortal在線工具對來自于TCGA等11個研究計劃的前列腺癌樣本集合的數(shù)據(jù)進行分析，總結KHDRBS家族基因在樣本集合中基因改變的比例、表達水平以及與總生存及無病生存期的關系;2）應用Real-time PCR檢測

5、前列腺癌細胞系22RV1、LnCap、DU145和PC3細胞mRNA表達水平。
　　結果:1）基于cBioPortal調用的11個樣本集合，與KHDRBS1相比，KHDRBS2和3在PCa樣本集合中的基因改變發(fā)生更為廣泛，并且KHDRBS3能夠影響樣本集合中患者的總生存，提示KHDRBS2和3可能與PCa發(fā)生發(fā)展相關。2）樣本均為去勢抵抗性前列腺癌及去勢抵抗性神經內分泌前列腺癌的NEPC樣本集合中，KHDRBS1，2和3基因發(fā)生改

6、變的樣本比例最高，提示KHDRBS家族可能與去勢抵抗性前列腺癌進展有關。3）KHDRBS1在22RV1、LnCap、DU145和PC3中均有表達。22RV1細胞中KHDRBS2高表達，KHDRBS3低表達;而PC3細胞中KHDRBS2低表達，KHDRBS3高表達。提示二者的表達具有細胞類型特異性。
　　二、KHDRBS2和3對前列腺癌細胞的作用
　　方法:1）應用瞬時轉染過表達及慢病毒轉染敲減改變KHDRBS2和3在22RV

7、1和PC3細胞中的表達水平，并應用Muse細胞儀、Transwell法及CCK-8法和體內成瘤實驗分別檢測細胞的細胞周期、遷移、侵襲及體外和體內的增殖能力。2）同前法改變KHDRBS2和3在22RV1和PC3細胞中的表達水平，應用Real-time PCR及Western-Blot檢測對應細胞中KHDRBS2和3的變化，明確KHDRBS2和3在前列腺癌細胞中的關系。
　　結果:1）瞬時過表達能夠成功構建高表達KHDRBS2和3的P

8、C3和22RV1細胞模型;2）慢病毒轉染敲減KHDRBS2或3能夠成功構建低表達KHDRBS2的22RV1或低表達KHDRBS3的PC3細胞模型;3）敲減KHDRBS2能夠抑制22RV1細胞的增殖能力，而敲減KHDRBS3能夠抑制PC3細胞的增殖能力;4）過表達或敲減KHDRBS2后KHDRBS3在mRNA和蛋白水平的表達發(fā)生降低或增高改變，而過表達或敲減KHDRBS3之后KHDRBS2的表達水平也發(fā)生降低或增高，但改變KHDRBS2或

9、3的表達對KHDRBS1的表達水平則無影響。
　　三、KHDRBS家族與雄激素受體的關系
　　方法:1）應用Real-time PCR檢測22RV1、LnCap、DU145和PC3細胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es的表達水平。2）應用Real-time PCR檢測有無雄激素及AR拮抗劑的條件下，22RV1細胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es及22RV1和PC3細胞中KHDRBS1，2和3的表達水平。3）

10、應用Real-time PCR檢測過表達KHDRBS2和3及敲減KHDRBS2的22RV1細胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es的表達水平。4)在有無雄激素的條件下，應用Real-time PCR檢測過表達KHDRBS2和3的22RV1細胞中KHDRBS2和3的mRNA表達變化以及敲減KHDRBS2的22RV1細胞中KHDRBS2、KHDRBS3、AR和AR-V7的mRNA表達變化。
　　結果:1）22RV1細胞中AR-F

11、L、AR-V7和AR-V567es高表達;而在PC3細胞中三種AR異構體均低表達。2）無雄激素條件下22RV1細胞中AR、AR-V7和AR-V567es及KHDRBS1和2表達水平較正常培養(yǎng)組顯著升高，具有統(tǒng)計學意義，KHDRBS3雖有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義;在PC3中，同樣處理對于KHDRBS家族基因的表達無影響;3）敲減KHDRBS2可顯著降低22RV1細胞中AR-V7的表達水平，P值為0.0168。4）過表達KHDRBS2和3以

12、及敲減KHDRBS2的22RV1細胞，無論是否添加雄激素，KHDRBS2、KHDRBS3、AR和AR-V7的mRNA表達變化與未做過表達和敲減的22RV1細胞對雄激素的反應一致。
　　研究結論:
　　1.cBioPortal分析前列腺癌樣本提示KHDRBS2和3可能在前列腺癌及去勢抵抗性前列腺癌發(fā)生進展中具有重要作用。
　　2.在22RV1和PC3細胞，KHDRBS2和3的表達具有細胞類型特異性并與AR及其異構體表達表