核酶特異性阻斷雄激素受體基因表達對前列腺癌細胞生長的影響.pdf

1、[目的] 1.體外證實錘頭狀核酶對短片段雄激素受體(AR)mRNA的切割活性。 2.研究錘頭狀核酶在細胞內(nèi)對AR基因表達的調(diào)節(jié)作用。 3.探討錘頭狀核酶調(diào)節(jié)AR基因表達，對前列腺癌細胞生長的影響。 [方法] 1.應(yīng)用計算機軟件模擬ARmRNA二級結(jié)構(gòu)進行，設(shè)計并化學合成含T7啟動子的特異性抗AR錘頭狀核酶(RZ)，PCR擴增AR基因片斷，構(gòu)建含T7啟動子的底物模板鏈，體外轉(zhuǎn)錄合成59ntRZ和255

2、ntARRNA；在37℃條件下，進行體外切割反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠電泳、放射自顯影后圖像分析計算切割率。 2.構(gòu)建特異性抗AR核酶表達載體，脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染雄激素受體表達陽性細胞T47D，1～3天后，免疫組化和RT-PCR檢測AR的蛋白質(zhì)及其基因表達水平。 3.在脂質(zhì)體介導下，錘頭狀抗雄激素受體核酶表達載體轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞株，采用RT-PCR檢測ARmRNA，MTT法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞周期時相，

3、原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(TUNEL)檢測細胞凋亡。 [結(jié)果] 1.體外轉(zhuǎn)錄出的核酶及ARmRNA于37℃體外反應(yīng)1小時，RZ可將255nt的ARmRNA底物完全切割為168nt和87nt的產(chǎn)物。 2.AR特異性核酶表達載體轉(zhuǎn)染T47D細胞后，ARmRNA水平降低22.4％～50.7％(P＜0.05)，AR蛋白陽性細胞減少7.10％～11.9％(P＜0.05)。 3.核酶表達載體轉(zhuǎn)染1～5天后，前列腺癌細胞ARm

4、RNA水平降低32.6％～40.7％(P＜0.05)，細胞生長抑制率18.28％～35.34％(P＜0.05)，細胞周期阻滯于G2/M期，誘導細胞凋亡，細胞凋亡比率較對照組增加20.7％(P＜0.01)。 [結(jié)論] 1.AR錘頭狀核酶對底物RNA具有良好的體外切割活性，為進一步阻斷AR基因表達奠定了基礎(chǔ)。 2.錘頭狀核酶特異性切割A(yù)RmRNA并下調(diào)其基因表達，誘導前列腺癌細胞凋亡，有可能成為前列腺癌基因治療的有效