PAK6通過泛素化負(fù)向調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞雄激素受體信號通路.pdf

1、目的：
　　 前列腺癌是歐美國家最常見的惡性腫瘤之一，在導(dǎo)致男性死亡的癌癥中排第三位。截至2009年全世界約有660，000男性被診斷為前列腺癌，并有250，000男性死于此病。因此，它依舊是威脅人類健康的一個主要問題。早在六十多年前，就已經(jīng)證實(shí)雄激素在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。因此，去除雄激素也稱去勢治療成為前列腺癌治療的主流。這種治療方式最初是有效的，然而，在去勢治療2-3年后，復(fù)發(fā)性前列腺癌中的雄激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又恢

2、復(fù)了，雄激素受體在雄激素剝奪后也擔(dān)當(dāng)著重要的角色。前列腺癌的發(fā)病原因迄今仍不清楚，目前認(rèn)為激素、人種、遺傳和飲食習(xí)慣等與發(fā)病都有比較密切的關(guān)系，其中雄激素在前列腺(癌)的生長、轉(zhuǎn)移與分化中起決定性作用，由雄激素依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆允敲總€致死性前列腺癌細(xì)胞的根本特性。目前沒有治療復(fù)發(fā)性前列腺癌的有效方案，因此，研究雄激素受體信號通路為分析前列腺癌的發(fā)生發(fā)展提供更多的依據(jù)，并為新的診斷治療策略提供理論基礎(chǔ)。
　　 雄激素與雄激

3、素受體結(jié)合后發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)控大量下游靶基因的表達(dá)，同時(shí)又受到雄激素受體關(guān)聯(lián)蛋白等旁路信號的調(diào)節(jié)。雄激素受體是核受體超家族的配體依賴式轉(zhuǎn)錄因子，其信號通路對包括前列腺在內(nèi)的男性泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育、功能及穩(wěn)定是必不可少的，并且在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用。在前列腺癌的各個階段中，雄激素受體都有一定程度的表達(dá)，并且在人及動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，前列腺癌的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中雄激素受體的表達(dá)水平與疾病的進(jìn)程相關(guān)。然而雄激素受體

4、并不是獨(dú)立的對雄激素產(chǎn)生應(yīng)答，而是需要與不同的轉(zhuǎn)錄輔因子發(fā)生相互作用而發(fā)揮其應(yīng)答作用。無論是雄激素受體自身的改變還是其轉(zhuǎn)錄輔因子的改變都能導(dǎo)致AR信號通路的異常。因此，雄激素受體本身及其相關(guān)的輔助調(diào)節(jié)因子影響著前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。盡管對AR的轉(zhuǎn)錄輔因子的調(diào)節(jié)功能做了大量的研究，但它們在前列腺癌中的作用仍有待于進(jìn)一步探索。
　　 p21活化激酶(p21-activated kinase，PAK)，為一類進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋

5、白激酶。PAK在許多組織中廣泛表達(dá)，作為小G蛋白Rho家族Cdc42和Racl的下游靶蛋白，可以被生長因子及其他胞外信號通過GTP酶依賴的信號通路或非GTP酶依賴的信號通路活化，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。PAK作為一種重要的生物學(xué)調(diào)節(jié)因子，在哺乳動物細(xì)胞中具有重要作用，如：細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞生存、細(xì)胞周期、血管生成、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。通過對PAK家族成員信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究，有望為癌癥治療提供分子靶標(biāo)。
　　 到目前為止PAK

6、家族共有6個成員：PAK1-PAK6，根據(jù)他們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及相似性，可分為兩大類。第一個亞類包括PAK1(PAKα)、PAK2(PAKγ)、PAK3(PAKβ)，它們的催化區(qū)中有80％-90%的序列同源性。較晚發(fā)現(xiàn)的第二亞類中含有PAK4、PAK5和PAK6，它們也彼此關(guān)系密切，但和第一亞系中的PAK1、PAK2和PAK3催化區(qū)序列同源性只有40%-50%，兩類PAK在結(jié)構(gòu)組成和調(diào)節(jié)上都有很顯著的差異，也預(yù)示著它們有著不同的下游效應(yīng)器。目

7、前對Ⅱ類PAK的研究主要是與腫瘤相關(guān)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附以及非錨定依賴性生長。PAK6作為Ⅱ類PAK的一員，有報(bào)道PAK6能與雄激素受體相互作用作為轉(zhuǎn)錄抑制子下調(diào)其轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　 本研究在體內(nèi)外證實(shí)PAK6能夠與雄激素受體AR發(fā)生相互作用，首次發(fā)現(xiàn)PAK6可定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；篩選出PAK6在雄激素受體AR上的磷酸化區(qū)域及位點(diǎn)。用共聚焦激光顯微鏡技術(shù)，免疫共沉淀和啟動子報(bào)告基因等細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)研究PAK6在調(diào)控AR

8、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的功能及其機(jī)制，探討PAK6在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找前列腺癌的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　 一、PAK6與AR在體內(nèi)外的相互作用及磷酸化位點(diǎn)的篩選
　　 1、用GST-pull down實(shí)驗(yàn)鑒定PAK6與AR在體外的相互作用并確定其作用區(qū)域。
　　 克隆PAK6和AR基因及其截短突變片段，構(gòu)建至不同質(zhì)粒載體中；GST-pulldown實(shí)驗(yàn)確定PAK6與AR相互作用區(qū)域。

9、
　　 2、利用激酶分析實(shí)驗(yàn)篩選PAK6對AR的磷酸化位點(diǎn)。
　　 3、在工具細(xì)胞HEK293中，共焦激光掃描顯微鏡觀察PAK6的亞細(xì)胞定位。
　　 4、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定PAK6，AR與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　 5、在工具細(xì)胞HEK293中，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察PAK6蛋白各截短區(qū)域在細(xì)胞中的定位。
　　 二、PAK6對AR下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　 1、利用Dual

10、-Luciferase Assay System分析PAK6在工具細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞系中參與AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 2、在工具細(xì)胞HEK293中，利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察PAK6野生型和激酶死型對于AR轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核的影響。
　　 3、在前列腺癌細(xì)胞PC-3中，利用Western Blot檢測PAK6對AR下游靶基因PSA及MMP2表達(dá)的影響。
　　 4、在前列腺癌細(xì)胞PC-3中，利用Western Bl

11、ot檢測核漿蛋白分離后PAK6對AR磷酸化水平的影響。
　　 5、利用Transwell assay檢測PAK6對前列腺癌細(xì)胞CWR22Rvl的遷移能力的影響。
　　 三、PAK6促進(jìn)Mdm2誘導(dǎo)AR經(jīng)蛋白酶體泛素化降解
　　 1、在工具細(xì)胞HEK293中，利用Western Blot檢測PAK6對AR的蛋白合成水平的調(diào)控。
　　 2、在工具細(xì)胞HEK293及前列腺癌細(xì)胞PC-3中，利用Western B

12、lot檢測PAK6對AR的泛素化蛋白水平的調(diào)控。
　　 3、在前列腺癌細(xì)胞CWR22Rv1中，利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK6與Mdm2在前列腺癌中參與AR對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 4、在前列腺癌細(xì)胞PC-3中，利用Western Blot檢測PAK6與Mdm2對AR下游靶基因PSA及MMP2表達(dá)的影響。
　　 5、在前列腺癌細(xì)胞CWR22Rv1中，利用共聚焦激光顯微鏡觀

13、察PAK6與Mdm2的共定位。
　　 6、在前列腺癌細(xì)胞CWR22Rv1中，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測PAK6與Mdm2的細(xì)胞內(nèi)相互作用。
　　 7、在工具細(xì)胞HEK293中，利用免疫共沉淀檢測PAK6與Mdm2對AR的泛素化蛋白水平的調(diào)控。
　　 結(jié)果
　　 一、PAK6與AR在體內(nèi)外的相互作用及磷酸化位點(diǎn)的篩選
　　 1、GST-pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK6與AR在體外的相互作用并確定其相互作用

14、區(qū)域。
　　 2、利用激酶分析實(shí)驗(yàn)確定PAK6對AR的磷酸化位點(diǎn)為絲氨酸578位點(diǎn)。
　　 3、在工具細(xì)胞HEK293中，共焦激光掃描顯微鏡觀察PAK6定位在細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。
　　 4、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定PAK6，AR與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。
　　 5、在工具細(xì)胞HEK293中，共焦激光掃描顯微鏡觀察到PAK6蛋白各截短區(qū)域在細(xì)胞中的定位。
　　 二、PAK6對AR下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)

15、控
　　 1、利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK6在工具細(xì)胞或前列腺癌細(xì)胞系中能夠下調(diào)AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 2、在工具細(xì)胞HEK293中，利用Western Blot證實(shí)PAK6對AR下游靶基因PSA及MMP2表達(dá)的負(fù)性調(diào)控。
　　 3、在前列腺癌細(xì)胞PC-3中，利用共聚焦激光顯微鏡技術(shù)觀察到PAK6野生型和激酶死型對于AR進(jìn)入細(xì)胞核的影響。
　　 4、在前列腺癌

16、細(xì)胞PC-3中，利用核漿蛋白分離及Western Blot試驗(yàn)證實(shí)PAK6野生型在細(xì)胞質(zhì)中增加了對AR的磷酸化作用。
　　 5、利用Transwell assay檢測PAK6能夠抑制前列腺癌細(xì)胞CWR22Rv1的遷移。
　　 三、PAK6促進(jìn)Mdm2誘導(dǎo)AR經(jīng)蛋白酶體泛素化降解
　　 1、在工具細(xì)胞HEK293中，利用Western Blot檢測PAK6影響AR的蛋白合成。
　　 2、在工具細(xì)胞HEK29

17、3及前列腺癌細(xì)胞PC-3中，利用Western Blot檢測PAK6能夠誘導(dǎo)AR經(jīng)蛋白酶體泛素化降解。
　　 3、在前列腺癌細(xì)胞CWR22Rv1中，利用Dual-Luciferase Assay System分析PAK6與Mdm2在前列腺癌中參與對AR靶基因的負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 4、在前列腺癌細(xì)胞PC-3中，利用Western Blot檢測PAK6與Mdm2對AR下游靶蛋白PSA及MMP2進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。
　　

18、5、在前列腺癌細(xì)胞CWR22Rv1中，利用共聚焦激光顯微鏡觀察PAK6與Mdm2的共定位。
　　 6、在前列腺癌細(xì)胞CWR22Rv1中，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK6與Mdm2的細(xì)胞內(nèi)相互作用。
　　 7、在工具細(xì)胞HEK293中，利用免疫共沉淀證實(shí)PAK6促進(jìn)Mdm2誘導(dǎo)AR經(jīng)蛋白酶體泛素化降解。
　　 結(jié)論
　　 1、PAK6與AR可以在體內(nèi)外發(fā)生相互作用。
　　 2、PAK6對AR的磷酸化位點(diǎn)在

19、絲氨酸578位。
　　 3、PAK6與AR共同定位于HEK293細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。
　　 4、PAK6可以激酶依賴性方式延遲AR轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。
　　 5、PAK6作為AR的轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制AR對其反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 6、PAK6能夠抑制下游靶基因PSA和MMP2的蛋白表達(dá)。
　　 7、PAK6能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移。
　　 8、PAK6可以激酶依賴性的方式促進(jìn)Mdm2誘導(dǎo)AR經(jīng)蛋