miRNAs在前列腺癌LNCaP細(xì)胞雄激素非依賴轉(zhuǎn)變過程中的表達(dá)變化.pdf

1、目的：
　　 1、構(gòu)建激素依賴性前列腺癌和激素非依賴性前列腺癌的miRNAs表達(dá)譜。
　　 2、找出與前列腺癌雄激素非依賴性轉(zhuǎn)變過程相關(guān)的miRNAs。
　　 方法：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)以雄激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組,長(zhǎng)期培養(yǎng)在加有氟他胺的無(wú)雄激素環(huán)境中培養(yǎng)的雄激素非依賴性LNCaP細(xì)胞即AI-LNCaP為實(shí)驗(yàn)組,兩組細(xì)胞于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),平均三天換培養(yǎng)液一次,六天傳代一

2、次。
　　 2、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞平行傳代后的第四天,(此時(shí)兩組細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,培養(yǎng)瓶底達(dá)80％覆蓋率),收集細(xì)胞。
　　 3、采用Ambion公司提供的mirVanaTM PARIS Kit提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總RNA,此過程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
　　 4、取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組總RNA各1μl,用DEPC水稀釋后70°變性2分鐘,上Agilent2100對(duì)樣品的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。
　　 5、聚

3、丙烯酰胺凝膠電泳分離小片段RNA,割膠分離,對(duì)小分子RNA進(jìn)行絕對(duì)定量后用solexa高通量測(cè)序儀對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小片段RNA(<40nt)進(jìn)行測(cè)序。
　　 6、solexa測(cè)序所得出的數(shù)據(jù)與人基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析。
　　 7、將測(cè)序所得出的sRNA序列信息和miRNA文庫(kù)比對(duì)分析,篩選出兩組細(xì)胞表達(dá)的miRNAs。
　　 8、對(duì)solexa測(cè)序得出的miRNAs原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,篩選出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異

4、表達(dá)的miRNAs。
　　 9、實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)篩選出差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：
　　 1、平行傳代后第五天將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞于倒置顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好,折光性好,細(xì)胞瓶底覆蓋率達(dá)70-80％,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,可以用于試驗(yàn)。
　　 2、Agilent2100對(duì)所提取總RNA進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總RNA的RIN值為9.8,28s:18s=2.1,對(duì)照組細(xì)胞RIN

5、值為9.4,28s:18s=1.9,所提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA未發(fā)生降解,其完整性、純度及總量均符合solexa樣品制備要求。
　　 3、Solexa測(cè)序的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)度為22nt的小分子RNA占所有測(cè)序結(jié)果的41.88％,測(cè)序無(wú)雜峰干擾的小分子RNA序列占68.83％；對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)度為22nt的小分子RNA占所有測(cè)序結(jié)果的42.10％,測(cè)序無(wú)雜峰干擾的小分子RNA序列占74.57％。
　　 4、So

6、lexa測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)與人基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示測(cè)序結(jié)果與基因組序列有良好的符合率。實(shí)驗(yàn)組測(cè)序的結(jié)果分析顯示全長(zhǎng)sRNA序列與基因組序列的符合是74.25％,每條sRNA序列的表達(dá)量與基因組序列的符合率是93.63％；對(duì)照組細(xì)胞測(cè)序結(jié)果分析顯示全長(zhǎng)sRNA序列與基因組序列的符合是62％,每條sRNA序列的表達(dá)量與基因組序列的符合率是94.18％。兩組細(xì)胞間公共序列分析結(jié)果顯示:兩組間共同表達(dá)的小分子RNA占所測(cè)出的小分子R

7、NA的88.90％,；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)而對(duì)照組細(xì)胞不表達(dá)的小分子RNA占所測(cè)出的小分子RNA7.50％；對(duì)照組細(xì)胞表達(dá)而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞不表達(dá)的小分子RNA占所測(cè)出的小分子RNA3.60％。
　　 5、sRNA與miRBase的比對(duì)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞檢測(cè)出miRNA共376個(gè),對(duì)照組細(xì)胞檢測(cè)出miRNA共357個(gè)。
　　 6、以差異倍數(shù)≥2.0和p≤0.001為標(biāo)準(zhǔn)篩選出實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞之間差異表達(dá)的miRNAs共94個(gè)

8、,其中48個(gè)表達(dá)上調(diào),46個(gè)表達(dá)下調(diào)。
　　 7、采用Mireap軟件共預(yù)測(cè)出15個(gè)新的miRNAs,其中實(shí)驗(yàn)組AI-LNCaP細(xì)胞中9個(gè),對(duì)照組LNCaP細(xì)胞中6個(gè)。熒光定量PCR得到驗(yàn)證的有9個(gè)miRaNAs。
　　 8、熒光定量:PCR驗(yàn)證在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的miRNAs,結(jié)果具有較好的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功篩選出實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞之間差異表達(dá)的miRNAs,篩選出的在