EpCAM與雄激素非依賴性前列腺癌發(fā)生的相關性研究.pdf

1、雄激素抵抗性前列腺癌是前列腺癌致死的主要原因。關于雄激素抵抗性前列腺癌發(fā)病機制的研究目前已經成為前列腺癌研究的熱點之一。上皮細胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一類I型跨膜糖蛋白,其在正常組織中只局限性的表達在上皮組織的基底膜處,但在快速增殖的腫瘤細胞中則大量表達。EpCAM在腫瘤組織中的過度表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關,已經成為腫瘤診斷和靶向治療重要的候選分子。關于E

2、pCAM在前列腺癌組織中的表達與雄激素抵抗性前列腺癌的發(fā)生相關性的研究目前還鮮有報道。
　　本研究利用免疫組織化學和前列腺癌組織芯片技術在6例正常前列腺組織、24例前列腺增生組織及210例前列腺癌組織中檢測了EpCAM蛋白的表達差異。結果顯示:EpCAM蛋白在正常前列腺組織表達量較低且主要局限性表達在前列腺管腔上皮細胞的基底膜處,在管腔上皮的細胞間連接處僅有極少量表達。在前列腺增生組織中,EpCAM的表達量增高,其表達不僅在管腔上

3、皮組織的基底膜處且在管腔上皮細胞間連接處表達量也較高。在前列腺癌組織中,EpCAM的表達量顯著升高,且彌散的表達在前列腺管腔上皮細胞的各個部分,除了上皮細胞的基底部和細胞間連接處有大量的表達以外,在管腔上皮細胞的頂端也有大量的表達。Western-blot在前列腺癌組織及相應的癌旁組織中檢測 EpCAM的表達,結果進一步肯定了其在前列腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織。統(tǒng)計學分析結果顯示:EpCAM蛋白的高表達與前列腺癌的臨床病理分級、

4、淋巴結轉移、遠處轉移以及手術前血清中總的前列腺特異性抗原(Prostatespecific antigen,PSA)水平等具有明顯相關性,且EpCAM高表達的前列腺癌患者,其無轉移生存期和總生存期均顯著短于EpCAM低表達的前列腺癌患者。
　　Western-blot檢測四種前列腺癌細胞系DU-145,PC-3,LNCaP及VCaP中EpCAM的表達,結果顯示:LNCaP細胞中EpCAM的表達量最高,其次為PC-3細胞、DU-14

5、5細胞和VCaP細胞。采用shRNA干擾技術即利用EpCAM-shRNA慢病毒顆粒及相應的慢病毒shRNA載體顆粒感染前列腺癌LNCaP細胞并建立穩(wěn)定轉染的細胞系EpCAM-shRNA5和對照細胞系Vector3。在EpCAM-shRNA5和Vector3細胞中分別檢測雄激素受體(Androgen receptor,AR)及PSA的表達水平,結果顯示:EpCAM-shRNA5細胞中,AR和PSA的表達水平明顯低于Vector3細胞。EL

6、ISA法檢測EpCAM-shRNA5細胞培養(yǎng)上清中的PSA水平同樣低于Vector3細胞。MTT法、TUNEL法、Annexin V/PI雙染法、細胞劃痕實驗以及Transwell實驗分別用來在體外檢測EpCAM-shRNA5和Vector3細胞的增殖、抗凋亡、遷移以及侵襲能力,結果顯示EpCAM-shRNA5細胞的增殖、抗凋亡、遷移以及侵襲能力均顯著低于對照組Vector3細胞。采用小鼠體內腫瘤種植模型進一步在體內檢測兩種細胞的腫瘤形

7、成能力,結果顯示EpCAM-shRNA5細胞的體內成瘤能力明顯低于Vector3細胞。我們的研究結果提示:EpCAM在前列腺癌組織中的過度表達可能通過促進前列腺癌細胞中AR的表達來使得前列腺癌細胞能夠適應去勢雄激素水平而繼續(xù)存活。
　　對EpCAM-shRNA5和Vector3細胞進行體外培養(yǎng)時可以觀察到Vector3細胞與 LNCaP細胞相比形態(tài)變化不大,即均為紡錘狀,并有細絲狀的偽足,細胞間連接幾乎不存在。而EpCAM-shR

8、NA5細胞形態(tài)則由細長的紡錘狀變?yōu)檩^規(guī)則的卵石狀,細絲狀偽足消失,且細胞間出現(xiàn)了比較稀疏的細胞間連接。這些形態(tài)變化提示EpCAM的表達可能促進上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。進一步在EpCAM-shRNA5和Vector3細胞中檢測EMT發(fā)生相關的蛋白標志物,結果顯示:與Vector3細胞相比EpCAM-shRNA5細胞中上皮細胞特異性蛋白E-cadherin和Cytoker

9、atin的表達增高而間質細胞特異性蛋白Vimentin和Fibronectin表達降低。利用免疫熒光染色法進一步肯定了EpCAM可促進EMT的發(fā)生。由于EMT的發(fā)生會賦予細胞干細胞的特性,同時EpCAM在一些腫瘤組織中也被看作干細胞的標記物。因此,我們進一步驗證EpCAM-shRNA5和Vector3細胞是否具有干細胞方面的特性。首先,利用平板克隆形成實驗檢測兩種細胞的克隆形成能力,結果顯示:EpCAM-shRNA5細胞的克隆形成能力顯

10、著低于Vector3。進一步檢測干細胞相關的轉錄因子OCT4,SOX2,NANOG的表達,結果顯示:EpCAM-shRNA5細胞中三種干細胞相關轉錄因子的表達水平明顯低于Vector3細胞。提示EpCAM不僅可以通過上調AR水平來提高前列腺癌細胞對去勢水平雄激素的耐受,同時還可以通過促進 EMT的發(fā)生及腫瘤細胞的干細胞特性的表達來提高前列腺癌細胞在去勢水雄激素平下的生存能力。
　　綜上所述,我們的研究首次將EpCAM在前列腺組織中