5Aza-dc對(duì)Du145前列腺癌細(xì)胞株RASSF1A基因去甲基化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本文旨在探討前列腺癌的表遺傳學(xué)發(fā)生發(fā)展機(jī)制，包括： 1、甲基化抑制劑與多種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，探討二者間的協(xié)同作用，增強(qiáng)化療藥物療效； 2、體外應(yīng)用甲基化抑制劑對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU145的RASSF1A基因甲基化水平的影響； 3、體外應(yīng)用甲基化抑制劑對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU145的RASSF1A基因及蛋白表達(dá)的影響，以期為進(jìn)一步深入探索通過改變抑癌基因的甲基化而為前列腺癌發(fā)生機(jī)制和基因治療提供有意義的數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

2、 研究方法： 1、對(duì)已知存在RASSF1A基因甲基化的前列腺癌細(xì)胞DU145應(yīng)用去甲基化劑5Aza-dc誘導(dǎo)處理，應(yīng)用MTT法檢測5Aza-dc及其他抗腫瘤藥物對(duì)Du145細(xì)胞存活率的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡率的變化。 2、應(yīng)用RT-PCR和MSP方法，比較甲基化抑制劑對(duì)人前列腺癌細(xì)胞處理前后RASSF1A基因mRNA和DNA表達(dá)水平。 3、在5Aza-dc處理腫瘤細(xì)胞后，采用Western blot方

3、法，對(duì)人前列腺癌細(xì)胞處理前后RASSFlA基因蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。 研究結(jié)果： 1、應(yīng)用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測，5Aza-dc可抑制Du145前列腺癌細(xì)胞的增殖；細(xì)胞凋亡增加。5Aza-dc濃度分別為1.0、2.0和4.0gmol/L，當(dāng)藥物濃度達(dá)到1.0μmol/L時(shí)出現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的生長的抑制作用，在一定范圍內(nèi)隨著劑量的增高，對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，5Aza-dc作用48h，前列腺癌細(xì)胞存活率分別為83.

4、4％、62.8％、43.2％。流式細(xì)胞儀檢測，5Aza-dc可以顯著增高前列腺癌細(xì)胞的凋亡率，作用呈劑量依賴性，在濃度達(dá)到4.0μmol/L時(shí)效果最明顯。 2、MSP，RT-PCR，Western blot顯示在應(yīng)用5Aza-dc處理前，Du145前列腺癌細(xì)胞RASSFlA基因呈甲基化狀態(tài)，RASSF1A基因mKNA及蛋白表達(dá)缺失，經(jīng)1.0、2.0及4.0μmol/L的5Aza-dc作用48h后，MSP顯示Du145前列腺癌細(xì)胞

5、RASSF1A基因甲基化逆轉(zhuǎn)；RT-PCR，Western blot顯示RASSF1A基因mRNA及蛋白表達(dá)恢復(fù)。 3、5Aza-dc與其他腫瘤化療藥物協(xié)同可顯著增強(qiáng)對(duì)前列腺癌細(xì)胞Du145的殺傷作用。經(jīng)MTT檢測，30μg/mL，60μg/mL，120μg/mL及240 μg/mL 5-FU，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL及16μg/mL ADM作用48h，前列腺癌細(xì)胞存活率分別為92.3％、80.2％、73.5％和

6、68.3％以及86.7％、73.5％、64.6％、582％加入終濃度為1.0μmol/L的5Aza-dc后，相同條件下細(xì)胞的存活率分別降為72.5％、57.1％、49.4％和42.5％；以及68.6％、53.2％、36.6％和28.7％。 研究結(jié)論： 1、RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致其失活的主要原因。 2、5Aza-dc能較好地逆轉(zhuǎn)前列腺癌細(xì)胞Du145的DNA異常甲基化，激活因高甲基化所致基因沉默的再轉(zhuǎn)