氧化應(yīng)激下ABCG2基因?qū)ι窖虿G丸支持細胞的影響及作用機制.pdf

1、支持細胞(Sertoli cell)為生精細胞的分化成熟提供支架，供給生精過程所需的營養(yǎng)物質(zhì)及能量，其次還可分泌多種蛋白及生長因子，具有天然的免疫豁免功能，是血睪屏障的重要組成部分，因其獨特的生物學(xué)特性，目前多用于組織工程、細胞療法，為細胞移植及糖尿病和帕金森病的治療開辟了廣闊的前景。但在用于細胞移植時，需對支持細胞進行體外培養(yǎng)，體外培養(yǎng)細胞過程是一個靜態(tài)系統(tǒng)，各種化學(xué)反應(yīng)中會產(chǎn)生過量的活性氧簇(ROS)，導(dǎo)致細胞受氧化應(yīng)激的影響而死亡

2、。近來研究表明，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G2(ATP-binding cassette transporters G2，ABCG2)廣泛定位于各種細胞質(zhì)膜上，能夠轉(zhuǎn)運和外排有害物質(zhì)，尤其對促進和維持應(yīng)激狀態(tài)下細胞的穩(wěn)定增殖方面具有重要作用，而Nrf2信號通路可調(diào)節(jié)ABCG2基因的轉(zhuǎn)錄，是細胞對抗氧化損傷的核心途徑之一，因此，研究在氧化應(yīng)激條件下ABCG2基因?qū)w外培養(yǎng)的支持細胞穩(wěn)定增殖的影響及作用機制具有一定意義。
　　本試驗首先構(gòu)建

3、山羊睪丸支持細胞(goat Sertoli cell，GSC)的氧化應(yīng)激模型，研究在氧化應(yīng)激狀態(tài)下ABCG2基因在GSC內(nèi)的表達和定位情況，闡明ABCG2基因?qū)SC穩(wěn)定增殖的影響;進而加入ABCG2基因的抑制劑，檢測ABCG2在Nrf2信號通路中對GSC穩(wěn)定增殖的調(diào)控，以明晰氧化應(yīng)激下ABCG2基因?qū)SC穩(wěn)定增殖的影響及其作用機制。
　　第一，以GSC為研究對象，分別加入不同濃度的H2O2，作用4h后，檢測各組GSC的存活率、

4、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的含量、超氧化物歧化酶的活性，對GSC進行核型分析并用流式細胞儀進行異倍體檢測。結(jié)果顯示，構(gòu)建GSC氧化應(yīng)激模型的最佳條件是200μM H2O2處理細胞4h。
　　第二，分別對對照組和氧化應(yīng)激組的GSC進行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄成DNA作為模板，根據(jù)Genbank中獲得的ABCG2基因序列合成引物，普通PCR擴增，運用熒光定量PCR技術(shù)和免疫組化技術(shù)對ABCG2進行表達和定位，并進行顯著性分析，結(jié)果顯示ABCG2基因在對

5、照組和氧化應(yīng)激組中均有表達，且表達量存在顯著差異，氧化應(yīng)激組ABCG2基因的表達量顯著高于對照組(P＜0.05)。
　　第三，對氧化應(yīng)激組的GSC加入ABCG2的抑制劑進行處理，然后進行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄成DNA作為模板，根據(jù)Genbank中獲得的Nrf2信號通路上的Nrf2、HO-1、NQO1基因序列合成引物，普通PCR擴增，運用熒光定量PCR技術(shù)進行表達并進行顯著性分析，結(jié)果顯示加抑制劑組Nrf2、HO-1、NQO1基因的表達