ABCG2表達變化對結直腸癌模型癌組織氧化應激指標及炎癥因子水平的影響.pdf

1、背景與目的：
　　結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，在我國常見惡性腫瘤中其死亡率位列第五。2015年國家衛(wèi)生計生委醫(yī)政醫(yī)管局、中華醫(yī)學會腫瘤學分會制訂的《中國結直腸癌診療規(guī)范》指出，我國2011年結直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別為23.03/10萬和11.11/10萬。結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多因素、多步驟的復雜過程。流行病學和腫瘤分子生物學表明氧化應激(oxidative stress

2、，OS)、炎癥與結直腸癌之間密切相關。氧化應激與炎癥反應產生或釋放的氧自由基、炎性細胞因子和趨化因子可誘導DNA損傷、細胞增生和血管生成而促發(fā)腫瘤。細胞膜三磷酸腺苷結合轉運蛋白超家族成員G2(ATP-binding cassette family G2，ABCG2)是一種由655個氨基酸殘基組成的跨膜糖蛋白，其編碼基因位于人類染色4q22，屬ABC基因家族。目前關于結直腸癌中ABCG2的研究主要涉及其作為藥物轉運子與化療耐藥機制的關系，

3、至于其它方面作用了解甚少。本課題組前期體外研究首次發(fā)現(xiàn)ABCG2具有保護結直腸細胞免受活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導的氧化應激損傷作用，該效應可能與ABCG2抑制細胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路及抑制相關炎癥因子表達有關。在此基礎上，本研究進一步觀察了人結直腸癌裸鼠模型中ABCG2表達變化對體內組織氧化應激指標及炎癥因子水平的影響，為結直腸癌靶向治

4、療提供新靶點和理論依據。
　　方法：
　　1、常規(guī)培養(yǎng)LoVo、HCT-116、HT-29三種人結腸癌細胞株。采用免疫印跡法(Western blot)檢測不同細胞株中ABCG2蛋白表達情況。從中選擇較高表達ABCG2的人結腸癌細胞作為后續(xù)研究對象。
　　2、采用shRNA慢病毒干擾系統(tǒng)抑制所選細胞株癌細胞內ABCCG2的表達（shABCG2組細胞），同時設立僅轉染病毒載體的陰性對照組（shcont組細胞）。利用熒光顯

5、微鏡觀察病毒感染效率，采用Western blot檢測兩組細胞中ABCG2蛋白水平，驗證ABCG2沉默效果。選擇合適的病毒感染復數（multiplicity of infection，MOI）及感染時間進行后續(xù)研究。
　　3、采用不同濃度（0、0.5、1.0 mM;）H2O2處理兩組細胞4h，用超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)檢測試劑盒和總谷胱甘肽(total glutathione)檢測試劑盒，分

6、別測定兩組細胞內SOD、總谷胱甘肽含量(GSH+GSSG)及谷胱甘肽還原酶(glutathionereductase，GR)活力;同時采用流式細胞術檢測兩組細胞凋亡狀況。
　　4、將shABCG2組細胞或shcont組細胞分別注入裸鼠皮下，建立人結直腸癌小鼠模型（分別為shABCG2組小鼠與shcont組小鼠）。
　　5、采用免疫熒光檢測法測定兩組小鼠移植瘤新鮮組織標本中ROS水平變化。
　　6、采用總谷胱甘肽檢測試劑

7、盒測定兩組小鼠移植瘤新鮮組織標本中總谷胱甘肽及GR水平。
　　7、采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測兩組小鼠移植瘤新鮮組織中白介素8(interleukin-8，IL-8)與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α，TNF-α)、血清中白介素-6(interleukin-6，IL-6)水平;采用實時定量聚合酶鏈式反應(real tim

8、e RT-PCR)檢測兩組小鼠移植瘤新鮮癌組織標本中IL-8、生長調節(jié)致癌基因β(growth regulated oncogene-β,GRO-β) mRNA水平。
　　8、采用Western blot及免疫組化法檢測兩組小鼠移植瘤新鮮組織中IκB-α和磷酸化IκB-α(phospho-IκB，p-IκB-α)表達狀況。
　　結果：
　　1、三株人結直腸癌細胞中ABCG2蛋白存在不同程度的表達，以HT-29細胞株AB

9、CG2表達相對較高，故選擇HT-29進行后續(xù)實驗。
　　2、熒光顯微鏡檢測可見細胞轉染病毒效率達90％以上，Western blot結果顯示shABCG2組細胞中ABCG2蛋白表達水平明顯低于shcont組細胞，表明ABCG2-shRNA慢病毒轉染能有效地抑制shABCG2組細胞內ABCG2表達，同時確定MOI值為20，轉染時間為24h。
　　3、與H2O2(0mM)未處理比較，0.5 mM或1.0mMH2O2處理兩組細胞4

10、h后，細胞內SOD與總谷胱甘肽水平均降低;而與shcont組細胞比較，0.5 mM或1.0 mM H2O2處理shABCG2組細胞后SOD與總谷胱甘肽含量降低更明顯。同時，隨著H2O2處理濃度增加，兩組細胞凋亡數也增多，但shABCG2組細胞凋亡程度均低于shcont組細胞。
　　4、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組織中ROS含量明顯增加。
　　5、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組

11、織中總谷胱甘肽含量和GR活力下降。
　　6、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組織中IL-8、TNF-α水平明顯增高，血清中IL-6含量明顯增高。
　　7、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組織中IL-8 mRNA水平未見變化，GRO-βmRNA水平明顯增高。
　　8、與shcont組小鼠比較，shABCG2組小鼠移植瘤組織中IκB-α表達下降，p-IκB蛋白表達上升。
　　結