溴酸鉀對(duì)HepG2細(xì)胞的遺傳毒性及氧化應(yīng)激機(jī)制的研究.pdf

1、前言:溴酸鉀(potassium bromate,PB)是飲用水臭氧消毒的副產(chǎn)物,在食品工業(yè)中曾廣泛用作面粉處理劑,用來(lái)改善面粉的品質(zhì)。因此,PB主要通過(guò)飲食而被人體攝入。鑒于研究發(fā)現(xiàn)PB存在致突變性和致癌性,我國(guó)和其他一些國(guó)家已禁止將其作為面粉處理劑繼續(xù)應(yīng)用。2007年7月1日實(shí)施的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中,我國(guó)首次將溴酸鹽納入飲用水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),規(guī)定在使用臭氧消毒時(shí),水質(zhì)溴酸鹽含量的限值為0.01毫克/升,與世界衛(wèi)生組織的制定標(biāo)準(zhǔn)一致。

2、
　　 國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)早在1987年就將PB歸為2B類(lèi)致癌物。PB是一種可增加人類(lèi)患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的化學(xué)物。此外,有研究發(fā)現(xiàn)顯示PB具有遺傳毒性,但有關(guān)遺傳毒性機(jī)制的研究不多。研究表明,PB可導(dǎo)致細(xì)胞中活性氧類(lèi)(ROS)生成增多,也能引起細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)——還原型谷胱甘肽(GSH)含量降低。另外,有研究發(fā)現(xiàn),溶酶體膜穩(wěn)定性改變和

3、線粒體膜電位變化也與遺傳毒性機(jī)制有關(guān)。因此,我們研究了PB遺傳毒性與細(xì)胞內(nèi)ROS與GSH含量以及溶酶體線粒體的關(guān)系,旨在探討PB遺傳毒性的氧化應(yīng)激機(jī)制。PB經(jīng)消化道途徑進(jìn)入體內(nèi),肝臟作為PB代謝的最初部位,因此本研究選用人肝癌細(xì)胞系(HepG2)作為試驗(yàn)系統(tǒng)。HepG2細(xì)胞保留了人類(lèi)正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的許多功能,還保留了生物轉(zhuǎn)化Ⅰ相酶和Ⅱ相酶的活性,被認(rèn)為是檢測(cè)外來(lái)化合物遺傳毒性的理想細(xì)胞系。
　　 本研究選用HepG2細(xì)胞,研究P

4、B的遺傳毒性及氧化性DNA損傷的機(jī)制,為進(jìn)一步評(píng)估PB對(duì)人類(lèi)的危害提供實(shí)驗(yàn)資料。
　　 方法:以HepG2細(xì)胞作為試驗(yàn)系統(tǒng)。通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗(yàn)及微核試驗(yàn)(MNT)檢測(cè)細(xì)胞DNA和染色體損傷情況,評(píng)價(jià)PB的遺傳毒性。為探討其可能的遺傳毒性機(jī)制,以2’,7’—二氫二氯熒光素(DCFH)法和苯二醛(OPT)分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS以及GSH水平,采用DL—甲硫氨酸磺酰亞胺(BSO)和羥基酪醇(HT)干預(yù)法觀察細(xì)胞內(nèi)GSH水

5、平對(duì)PB所致的DNA與染色體損傷效應(yīng)的影響,用吖啶橙(Acridine orange)和羅丹明123(Rhodamine123)分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性和線粒體膜電位的改變水平,以免疫組化方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS v11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:1.56mM-12.5mM的PB作用于HepG2細(xì)胞1h后,引起細(xì)胞DNA鏈斷裂,形成彗星樣脫尾,尾長(zhǎng)、尾DNA含

6、量及尾距均明顯大于未用PB處理的細(xì)胞。而相同劑量梯度下的PB接觸細(xì)胞40min,與未用PB處理細(xì)胞比較,未見(jiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別。12.5μM-50μM的HT預(yù)處理后,12.5mM的PB接觸HepG2細(xì)胞1h,不同劑量HT干預(yù)組形成的彗星樣脫尾,尾長(zhǎng)、尾DNA含量及尾距均明顯小于未用HT處理的細(xì)胞。0.12mM-1mM的PB作用于HepG2細(xì)胞24h可引起細(xì)胞微核率顯著升高。采用150μM的BSO預(yù)處理HepG2細(xì)胞20h,以耗竭細(xì)胞內(nèi)G

7、SH,可明顯增強(qiáng)PB對(duì)HepG2細(xì)胞DNA及染色體的損傷,且呈劑量依賴關(guān)系。采用50μM HT可提高細(xì)胞內(nèi)GSH水平,并可明顯地降低PB對(duì)HepG2細(xì)胞的染色體損傷效應(yīng)。PB作用于HepG2細(xì)胞可引起細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平的明顯增加以及細(xì)胞內(nèi)GSH的耗竭,PB的作用劑量分別12.5mM和1.56mM-12.5mM。6.25mM-12.5mM的PB作用于HepG2細(xì)胞3h后,細(xì)胞內(nèi)8-OHdG水平的表達(dá)增強(qiáng),與對(duì)照組比較,有明顯差別。6.2

8、5mM-12.5mM的PB作用于HepG2細(xì)胞可引起細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性明顯改變。而1.56mM-12.5mM的PB作用細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化,則未見(jiàn)明顯改變。
　　 結(jié)論:PB可引起HepG2細(xì)胞DNA損傷和染色體損傷,提示PB具有遺傳毒性。PB引起8-OHdG形成增強(qiáng),表明PB引起的DNA損傷為氧化性損傷。PB引起細(xì)胞內(nèi)ROS增高,GSH耗竭,8-OHdG的形成增強(qiáng)以及溶酶體膜穩(wěn)定性改變,表明PB引起遺傳毒性的機(jī)