氧化應(yīng)激介導(dǎo)的喹烯酮遺傳毒性及普洱茶水提取液保護(hù)作用研究.pdf

1、獸藥殘留不僅可能影響到畜禽等動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和正常生理機(jī)能的維持，而且可能通過食物鏈的生物富集作用影響人類的健康。相關(guān)研究證實(shí)人類腫瘤發(fā)病率的升高與許多環(huán)境污染有關(guān)，來自動(dòng)物食品的某些殘留獸藥的致突變和致癌作用可能是重要的原因之一。喹惡啉類藥物(Quinoxalines)是人工合成的一類具有喹惡啉-l，4-二氧化物（quinoxaline-1，4-dioxides，QdNOs）基本結(jié)構(gòu)的化合物，可抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，包括金黃色葡萄球

2、菌、大腸桿菌和沙門氏菌等。卡巴氧和喹乙醇作為兩種傳統(tǒng)的QdNOs，體內(nèi)和體外的大量研究發(fā)現(xiàn)這兩種藥物存在著潛在的致突變性和致癌性。正因?yàn)槿绱?，歐洲共同體委員會(huì)(Commission of the European Community，CEC)于1999年將這兩種化學(xué)物列為禁止使用的動(dòng)物促生長(zhǎng)劑。然而，作為一種新型的替代產(chǎn)品，喹烯酮（Quinocetone，QCT）與其他QdNOs也存在著相同的主體結(jié)構(gòu)，在大量關(guān)注其藥效的同時(shí)，喹烯酮藥物

3、使用的安全性也日益受到人們的關(guān)注。有限的資料顯示，體外研究報(bào)道，QCT可能導(dǎo)致細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞株的致突變作用，并能引起HepG2細(xì)胞株的DNA損傷。但是目前關(guān)于QCT在體內(nèi)引起致突變作用的研究很有限，且存在較大爭(zhēng)議，因此選用對(duì)致癌性化學(xué)物較敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群，并結(jié)合短期和長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)喹烯酮對(duì)哺乳動(dòng)物的遺傳毒性評(píng)價(jià)有重要的科學(xué)價(jià)值，并為制定相應(yīng)的使用規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)有參考價(jià)值。氧化應(yīng)激是許多外源化合物導(dǎo)致機(jī)體毒性作用的主要早期分子機(jī)

4、制之一，有研究證明QdNOs的一些成員如卡巴氧和喹乙醇誘導(dǎo)的DNA損傷與在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS堆積直接相關(guān)。由于QCT與其他QdNOs一樣具有相同的主體結(jié)構(gòu)，其代謝過程中是否也能引起機(jī)體氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致氧化性DNA損傷，目前還未見報(bào)道。
　　 許多研究已經(jīng)證實(shí)，應(yīng)激性反應(yīng)蛋白的激活是機(jī)體應(yīng)對(duì)外源化合物引起毒性作用的早期保護(hù)性機(jī)制，其中熱休克蛋白家族（heat shock protein，HSP）是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。在眾多候選基因之

5、中，血紅素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）因具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化和抗凋亡作用，因此與多種氧化應(yīng)激相關(guān)性損傷密切相關(guān)。正是由于HO-1對(duì)氧化損傷的多重防御效應(yīng)和良好的應(yīng)激性、可誘導(dǎo)性，近年來它已經(jīng)成為預(yù)防氧化損傷的重要靶基因，被廣泛關(guān)注。大量研究發(fā)現(xiàn)，多種膳食抗氧化物能夠誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)并發(fā)揮抗氧化功能。普洱茶是生長(zhǎng)在我國云貴高原特有的茶種，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)普洱茶提取液(BTE)具有較強(qiáng)的抗氧化作用，抗高脂血癥和減

6、肥功能，而發(fā)揮其功能作用的主要機(jī)制是能有有效清除體內(nèi)過多的活性氧自由基和活性氮物質(zhì)。提示普洱茶可能通過其強(qiáng)的抗氧化活性，降低外源性毒物引起機(jī)體的氧化性DNA損傷，進(jìn)而發(fā)揮其抗突變作用，但是這一推斷目前尚未在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明，此外關(guān)于普洱茶對(duì)HO-1的調(diào)節(jié)作用目前還沒有相關(guān)的研究。
　　 因此，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)喹烯酮在體內(nèi)的遺傳毒性及其分子毒作用機(jī)制，本研究通過急性和亞慢性暴露動(dòng)物染毒，探討氧化應(yīng)激與遺傳毒性之間的關(guān)系，并研究HO-1在

7、外源性化合物作用下在遺傳毒性中的分子靶點(diǎn)作用。同時(shí)，通過普洱茶提取液補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，探索研究BTE對(duì)QCT誘導(dǎo)的遺傳毒性的保護(hù)作用及其相關(guān)分子機(jī)制。
　　 第一部分、急性暴露下喹烯酮對(duì)Balb/c小鼠遺傳毒性研究
　　 目的：探討QCT對(duì)Balb/c小鼠的致突變作用，并初步探討QCT致突變作用與氧化應(yīng)激的相互關(guān)系。
　　 方法：雄性Balb/c小鼠（48只）及雌性小鼠（48只），同一性別小鼠隨機(jī)分為以下8組：（1）陰性

8、對(duì)照組（Control）：0.5％羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃；（2）喹烯酮高劑量組（QCT-H）：12000 mg/kg·bw；（3）喹烯酮中劑量組（QCT-M）：mg/kg·bw；（4）喹烯酮低劑量組（QCT-L）：3000 mg/kg·bw；（5）陽性對(duì)照組（CY）：環(huán)磷酰胺40 mg/kg·bw腹腔注射。第二次灌胃4 ~ 6 h頸椎脫臼處死動(dòng)物，取胸骨骨髓涂片，Giemsa染色檢查嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核發(fā)生率。取新鮮肝、腎組織，

9、制作單細(xì)胞懸液，堿性凝膠電泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)肝腎分離細(xì)胞DNA損傷程度。制作肝、腎組織冰凍切片，DHE染色，熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，并計(jì)算平均熒光密度。制備肝、腎組織線粒體勻漿，檢測(cè)GSH水平和總抗氧化能力（T-AOC），以及GPx，SOD和CAT活力。
　　 結(jié)果：
　　 （1）高劑量QCT組雌、雄性Balb/c小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率分別為9.2‰和9.4‰，均顯著性高于陰性對(duì)照組。中、低劑量QCT組小鼠微核發(fā)生率與陰性對(duì)照

10、組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 （2）彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示急性QCT暴露均可引起B(yǎng)alb/c小鼠肝、腎分離細(xì)胞的DNA損傷。對(duì)于肝分離細(xì)胞，除了3000 mg/kg·bw QCT組，其余QCT劑量組OTM值顯著性高于陰性對(duì)照組；對(duì)于腎分離細(xì)胞，所有QCT劑量組OTM均顯著性高于陰性對(duì)照組。
　　 （3）肝、腎細(xì)胞中ROS水平呈劑量依賴性升高，同時(shí)GSH水平和T-AOC水平在高劑量QCT組線粒體勻漿中顯著性低于對(duì)照組，GPx，SO

11、D和CAT活性也受到明顯抑制。
　　 結(jié)論：
　　 （1）喹烯酮急性暴露能夠引起B(yǎng)alb/c小鼠骨髓PCE微核實(shí)驗(yàn)陽性和肝、腎分離細(xì)胞DNA損傷程度增加，提示喹烯酮對(duì)哺乳動(dòng)物具有潛在的遺傳毒性。
　　 （2）喹烯酮急性暴露引起的遺傳毒性跟其代謝中產(chǎn)生過多的ROS以及對(duì)抗氧化系統(tǒng)的抑制有直接關(guān)系。
　　 第二部分、亞慢性暴露下喹烯酮對(duì)SD大鼠遺傳毒性及分子機(jī)制研究
　　 目的：以QCT在SD大鼠中的

12、亞慢性暴露造模，以肝臟為主要的靶器官，進(jìn)一步探討QCT較長(zhǎng)時(shí)期的暴露對(duì)大鼠的遺傳毒性及其分子機(jī)制。
　　 方法：成年雄性SD大鼠（160~180 g）72只隨機(jī)分為4組：喹烯酮高劑量組(QCT-H):2400 mg/kg/day; 喹烯酮中劑量組(QCT-M):800 mg/kg/day; 喹烯酮低劑量組(QCT-H):50 mg/kg/day；正常對(duì)照組(control)：0 mg/kg/day。在喂養(yǎng)期間分別于第5week（

13、8只）和第14 week（10只）處死一批老鼠，分別檢測(cè)血清ALT，AST，Cr和BUN水平和尿8-OHdG含量。制備13 week SD大鼠肝細(xì)胞懸液，彗星實(shí)驗(yàn)測(cè)定肝細(xì)胞DNA損傷程度。檢測(cè)肝細(xì)胞ROS水平以及肝組織勻漿中GSH，MDA含量，GPx，GST，GR，SOD和CAT活性。RT-PCR法檢測(cè)堿基切除修復(fù)相關(guān)基因OGG1，XRCC1，PARP1，PARP2和PARG mRNA水平。RT-PCR和western blot法分別檢

14、測(cè)炎癥相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，分別檢測(cè)喹烯酮暴露4 week和13 week SD大鼠肝臟HO-1蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 （1）2400 mg/kg/day 喹烯酮暴露組SD大鼠體重顯著性低于對(duì)照組，肝臟相對(duì)臟器重量顯著性高于正常對(duì)照組。血清生化結(jié)果顯示：QCT染毒大鼠血清ALT，AST水平呈劑量依賴型和時(shí)間依賴型升高，且高劑量QCT組大鼠血清ALT和AST水平均顯著性高于對(duì)照組（

15、P＜0.05）。此外肝臟病理結(jié)果顯示肝細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)大量空泡樣改變，匯管區(qū)出現(xiàn)單核細(xì)胞侵潤和結(jié)締組織增生性改變，可見少量肝細(xì)胞壞死和凋亡現(xiàn)象。
　　 （2）彗星結(jié)果顯示高劑量QCT組大鼠肝臟分離細(xì)胞DNA損傷程度明顯增加，其OTM和Tail DNA％值顯著性高于對(duì)照組（P＜0.01）。
　　 （3）肝細(xì)胞內(nèi)ROS，尿8-OHdG和肝組織勻漿MDA水平呈劑量依賴性升高，而抗氧化系統(tǒng)包括GSH水平，GPx，GST，GR，SOD和

16、CAT活力呈劑量依賴性降低。其中高劑量QCT組各個(gè)指標(biāo)與對(duì)照組相比，差異均具有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）。
　　 （4）與對(duì)照組相比，QCT亞慢性暴露后OGG1 mRNA表達(dá)呈劑量依賴性升高，其中高劑量QCT組大鼠肝臟OGG1 mRNA升至對(duì)照組的5.15倍（P＜0.01）。此外，在OGG1介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)通路相關(guān)酶 mRNA水平，如Xrcc1，PARP1和PARP2 mRNA表達(dá)水平均顯著性升高（P＜0.05）。<

17、br>　　 （5）高劑量QCT的亞慢性暴露，可直接造成NF-κB mRNA表達(dá)的上升，同時(shí)也增加iNOS，TNF-a和 Cox-2多個(gè)基因mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05）。高劑量QCT可造成p53 mRNA水平的顯著性增高，同時(shí)casepase-3 mRNA水平顯著性升高（P＜0.05），以及對(duì)凋亡反應(yīng)有一定抑制作用的Bcl-xl mRNA水平一定程度的下降，但是與對(duì)照組相比其差異沒有顯著性（P>0.05）。而各個(gè)基因蛋白表達(dá)水平與

18、mRNA水平相一致。
　　 （6）高劑量組HO-1蛋白水平呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性降低，其中QCT染毒三個(gè)月SD大鼠肝臟中HO-1蛋白水平顯著性低于對(duì)照組（P＜0.05），Nrf-2 mRNA水平和蛋白水平也顯著性低于對(duì)照組（P＜0.05），而Keap-1蛋白水平在各個(gè)組別之間沒有顯著性差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 (1)QCT亞慢性染毒可造成肝細(xì)胞DNA損傷程度增加和OGG1修復(fù)系統(tǒng)活化，并產(chǎn)生大

19、量的DNA加合物，進(jìn)一步提示其具有潛在的遺傳毒性。
　　 (2)HO-1的表達(dá)抑制造成的細(xì)胞內(nèi)高氧化應(yīng)激可能是QCT誘導(dǎo)的遺傳毒性的重要分子機(jī)制。
　　 第三部分、普洱茶水提取液對(duì)喹烯酮誘導(dǎo)的遺傳毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　 目的：探討普洱茶水提取液對(duì)喹烯酮亞慢性暴露所致遺傳的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 方法：成年雄性SD大鼠（160~180 g）40只隨機(jī)分為5組：喹烯酮染毒組 (QCT)：2400

20、mg/kg/day ; 普洱茶補(bǔ)充高劑量組(QCT+BTE-H):2400 mg/kg/day QCT+1000 mg/kg/day BTE; 普洱茶補(bǔ)充低劑量組(QCT+BTE-L):2400 mg/kg/day QCT+500 mg/kg/day BTE; 正常對(duì)照組(control)：正常進(jìn)食; 普洱茶對(duì)照組：1000 mg/kg/day BTE灌胃。所有SD大鼠喂養(yǎng)13周，每周記錄體重和進(jìn)食量，于13周末處死所有大鼠。分離血清檢

21、測(cè)ALT和AST水平，分離整個(gè)肝臟計(jì)算肝臟相對(duì)重量并做病理切片H&E染色。彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞DNA損傷程度，高效液相色譜電化學(xué)法檢測(cè)尿液8-OHdG水平，冰凍切片檢測(cè)肝細(xì)胞ROS水平，制作組織勻漿檢測(cè)GSH和MDA含量，GPx，GST，GR，SOD和CAT活性。RT-PCR法檢測(cè)HO-1，iNOS，TNF-a，Cox-2，p53，Bcl-xl和casepase-3 mRNA水平，western blot法檢測(cè)HO-1，Nrf-2，Kea

22、p-1，iNOS，NF-κB，Cox-2，Bcl-xl，casepase-3，ERK 42/44和pERK 42/44 (Thr202/Tyr204)蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 （1）喹烯酮染組SD大鼠體重，進(jìn)食量顯著性低于對(duì)照組，肝臟臟器系數(shù)，血清ALT和AST水平顯著性高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）。肝臟病理結(jié)果顯示肝細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)大量空泡樣改變，匯管區(qū)出現(xiàn)單核細(xì)胞侵潤和結(jié)締組織增生性改變，可見少量肝細(xì)

23、胞壞死和凋亡現(xiàn)象。BTE補(bǔ)充組能在一定程度上改善QCT染毒造成的肝功能損傷，表現(xiàn)為降低血清ALT和AST水平，減輕QCT染毒誘導(dǎo)的肝臟病理損傷。
　　 （2）各個(gè)劑量的BTE補(bǔ)充均能夠降低QCT染毒所致的DNA損傷，而BTE本身對(duì)肝細(xì)胞DNA沒有DNA損傷作用。
　　 （3）各個(gè)劑量的BTE補(bǔ)充能提高肝臟中HO-1 mRNA和蛋白水平，并能提高Nrf-2蛋白水平。此外Keap-1蛋白在BTE對(duì)照組呈高表達(dá)狀態(tài)，而其他各組

24、間的差別不顯著（P>0.05）。
　　 （4）各個(gè)組別間ERK42/44蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差別（P>0.05），但是BTE補(bǔ)充能提高ERK42/44的磷酸化水平。
　　 （5）BTE補(bǔ)充能有效降低QCT染毒引起的高ROS，8-OHdG和MDA狀態(tài)，并能上調(diào)肝臟線粒體抗氧化系統(tǒng)，包括GSH含量，GPx，GST，GR，SOD和CAT活力。
　　 （6）與QCT染毒組相比，BTE補(bǔ)充能夠改善SD大鼠肝臟炎癥反應(yīng)和細(xì)胞