氧化應(yīng)激和JNK信號途徑介導(dǎo)的INS-1細(xì)胞高糖毒性作用機(jī)制研究.pdf

1、葡萄糖是生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能的重要營養(yǎng)物質(zhì)。機(jī)體存在一定數(shù)量功能正常的β細(xì)胞是維持糖穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)。胰島β細(xì)胞功能減退導(dǎo)致葡萄糖代謝異常，促進(jìn)糖尿病發(fā)生。顯著的高血糖通過糖毒性作用進(jìn)一步損害β細(xì)胞功能是加速糖尿病病情進(jìn)展的病理生理機(jī)制。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)的活性氧（ROS）生成增加和(或)清除活性氧的能力降低，導(dǎo)致活性氧生成和清除失衡，機(jī)體內(nèi)過量的活性氧聚集導(dǎo)致組織、細(xì)胞功能受損。2型糖尿病患者因?yàn)楦哐?、高血脂?dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生

2、，過量的能量物質(zhì)代謝同時加重胰腺組織內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增加。在胰島細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與血糖的關(guān)系如何，高血糖是否通過胞內(nèi)活性氧損害了β細(xì)胞功能，氧化應(yīng)激是否參與形成糖毒性的機(jī)制是本課題研究的內(nèi)容之一。機(jī)體內(nèi)的各種信號系統(tǒng)通過相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。胰島素信號系統(tǒng)主要在胰島素靶器官表達(dá)，具有調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能和外周組織胰島素敏感性的重要地位。β細(xì)胞上的胰島素受體信號系統(tǒng)受損導(dǎo)致β細(xì)胞功能損害。JNK信號分子屬于應(yīng)激激活蛋白激酶

3、家族中的成員，在機(jī)體受到創(chuàng)傷、炎癥反應(yīng)、放射線照射時被激活，通過活化其下游底物主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與存活。β細(xì)胞內(nèi)存在JNK信號分子的表達(dá)，本研究通過觀察高糖環(huán)境是否激活β細(xì)胞內(nèi)的JNK 信號通路以及JNK信號通路與胰島素受體信號系統(tǒng)是否相互作用介導(dǎo)糖毒性的產(chǎn)生，從而為有效地減輕糖毒性，保護(hù)β細(xì)胞功能提供有價值的干預(yù)分子靶點(diǎn)。 一、不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，檢測細(xì)胞的活性與凋亡、基因轉(zhuǎn)錄功能。 1、觀察不同濃度的

4、葡萄糖作用不同時間對β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞活性和凋亡的影響：在5.6mmol/l（5.6G）、11.2mmol/l（11.2G）、33.3mmol/l（33.3G）葡萄糖濃度下培養(yǎng)INS-1細(xì)胞48、72小時，MTT方法檢測細(xì)胞活性，免疫熒光Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。RT-PCR方法檢測細(xì)胞胰島素、PDX-1、IAPP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，加入IGF-1以后檢測細(xì)胞活性和基因轉(zhuǎn)錄水

5、平改變。 2、高糖隨時間增加對INS-1細(xì)胞功能損傷程度加重：MTT活性檢測顯示一定范圍內(nèi)的葡萄糖濃度增加促進(jìn)細(xì)胞活性；隨葡萄糖濃度進(jìn)一步增加，細(xì)胞活性受抑制；72小時，33.3mmol/l葡萄糖濃度下，細(xì)胞活性抑制達(dá)17.7％（p<0.001）；Hoechst染色顯示培養(yǎng)72小時只有33.3G組INS-1細(xì)胞有明顯凋亡；流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)細(xì)胞72小時后33.3G組凋亡細(xì)胞比例為28.2％，是基礎(chǔ)對照組的2.49 倍（P<0.0

6、01）。隨葡萄糖濃度和培養(yǎng)時間增加，INS-1細(xì)胞的胰島素、PDX-1基因轉(zhuǎn)錄受抑制程度逐漸增加；加入細(xì)胞因子IGF-1以后可以改善細(xì)胞活性、增加胰島素和PDX-1的轉(zhuǎn)錄水平，但隨葡萄糖濃度增加，其促進(jìn)生長的作用減弱；培養(yǎng)48小時，11.2mmol/l、33.3mmol/l葡萄糖抑制IAPP的基因轉(zhuǎn)錄；長期高糖培養(yǎng)（72 小時），IAPP基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。IGF-1抑制IAPP的基因轉(zhuǎn)錄。 二、檢測不同濃度葡萄糖培養(yǎng)下INS-1細(xì)胞

7、內(nèi)活性氧（ROS）的水平，以及給與活性氧清除劑NAC以后，細(xì)胞功能的改變。 1、胞內(nèi)活性氧隨葡萄糖濃度增加而增加：培養(yǎng)48小時，11.2G和33.3G組胞內(nèi)ROS較對照組分別上升15％和32％，（P<0.001）。培養(yǎng)至72小時，11.2G組和33.3G組胞內(nèi)ROS較對照組分別增加25.3％和49.6％（P<0.001），給與NAC顯著降低不同糖濃度下的胞內(nèi)活性氧水平。 2、活性氧清除劑NAC改善高糖環(huán)境中的INS-1細(xì)

8、胞功能：加入NAC有效地改善了高糖環(huán)境中的INS-1細(xì)胞活性，48小時和72小時，33.3G組細(xì)胞活性較干預(yù)前分別增加28％和20％（P＜0.01）；細(xì)胞凋亡減少54％（P<0.001）；胰島素、PDX-1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，48小時內(nèi)可以完全逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境中的胰島素基因轉(zhuǎn)錄水平。 三、研究高糖損傷INS-1細(xì)胞功能的分子機(jī)制。 1、阻斷INK信號通路可以有效地改善INS-1細(xì)胞功能：給與JNK抑制劑SP600125以后

9、，48小時內(nèi)有效改善高濃度葡萄糖對INS-1細(xì)胞活性的抑制作用，72小時33.3G組細(xì)胞凋亡減少45％（P<0.001），表明JNK的激活在糖毒性導(dǎo)致的β細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了作用。此外高糖環(huán)境中的INS-1細(xì)胞胰島素和PDX的基因轉(zhuǎn)錄水平也在阻斷JNK通路后獲得部分恢復(fù)。 2、高糖通過激活JNK信號通路進(jìn)而抑制胰島素信號系統(tǒng)可能是糖毒性損傷胰島β細(xì)胞的分子機(jī)制之一高糖環(huán)境激活I(lǐng)NS-1細(xì)胞的JNK絲氨酸磷酸化，IGF-1抑制該位點(diǎn)的

10、磷酸化過程。同時高糖培養(yǎng)可以激活I(lǐng)RS-ser-270磷酸化，33.3G組磷酸化水平是11.2G組的1.17倍（P<0.01）。加入JNK抑制劑SP600125以后，各葡萄糖組JNK磷酸化水平顯著降低，33.3G組JNK磷酸化蛋白被抑制90％；加入SP600125后11.2G組和33.3G組IRS-Ser-270的磷酸化水平只是部分被抑制，分別下降88.3％和80％；加入IGF-1進(jìn)一步抑制IRS-Ser-270的絲氨酸水平。葡萄糖毒性

11、部分通過激活JNK信號途徑進(jìn)而抑制INS-1細(xì)胞的胰島素受體底物信號系統(tǒng)發(fā)揮作用。 結(jié)論： （1）一定濃度范圍內(nèi)的葡萄糖促進(jìn)INS-1細(xì)胞存活與生長。 （2）慢性長期高糖環(huán)境抑制INS-1細(xì)胞的活性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，損害其基因轉(zhuǎn)錄功能。 （3）高糖誘發(fā)INS-1細(xì)胞發(fā)生胞內(nèi)氧化應(yīng)激，給與抗氧化應(yīng)激干預(yù)顯著抑制胞內(nèi)氧化應(yīng)激，并有效的改善細(xì)胞活性、減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島素和PDX-1的基因轉(zhuǎn)錄。 （4）