MAPK信號(hào)通路對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降的介導(dǎo)作用的體外研究.pdf

1、目的:
　　體外研究MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降的介導(dǎo)作用。
　　方法:
　　①建立滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型：選用人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo，以不同濃度H2O2孵育HTR-8/SVneo細(xì)胞12h，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，熒光探針DCFH-DA標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。然后采用下述方法驗(yàn)證該模型：選擇合適濃度H2O2孵育細(xì)胞，Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式

2、細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞早期凋亡水平，TBA法和NBT法分別檢測(cè)HTR-8/SVneo細(xì)胞勻漿中MDA濃度和SOD活性。②檢測(cè)氧化應(yīng)激條件下滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力變化：H2O2孵育HTR-8/SVneo細(xì)胞24h，Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力；H2O2孵育細(xì)胞6h和12h，熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2/9mRNA水平，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2/9蛋白水平，明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性。③確定ERK

3、、JNK和p38磷酸化特異性抑制劑實(shí)驗(yàn)濃度：H2O2孵育HTR-8/SVneo細(xì)胞6h和12h，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK和p38磷酸化水平；分別用ERK、JNK和p38磷酸化特異性抑制劑孵育HTR-8/SVneo細(xì)胞1h，H2O2孵育細(xì)胞12h檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ERK、JNK和p38磷酸化水平。④分析MAPK信號(hào)通路對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降的介導(dǎo)作用：分別用ERK、JNK和p38磷酸化特異性抑制劑孵育HTR-8/

4、SVneo細(xì)胞1h，H2O2孵育細(xì)胞24h檢測(cè)細(xì)胞侵襲力變化，H2O2孵育細(xì)胞12h檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2/9mRNA和蛋白水平變化以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性變化。
　　結(jié)果:
　　1、造模：CCK-8實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，模型組H2O2濃度分別為25μM、50μM、75μM、100μM時(shí)，細(xì)胞活力均無(wú)明顯變化（均p＞0.05）。熒光探針DCFH-DA標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，H2O2濃度分別為25μM、50μM、

5、75μM時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平均無(wú)明顯變化（均p＞0.05），H2O2濃度分別為100μM、250μM、500μM、1000μM時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平均上升（均p＜0.05）。因此，H2O2濃度為75μM~100μM時(shí)均可在不影響細(xì)胞增殖的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)選用100μMH2O2進(jìn)行造模，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），細(xì)胞勻漿MDA濃度和SOD活性均增加（p＜0.05），提示造模成功。

6、　　2、氧化應(yīng)激條件下滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力變化：與對(duì)照組比較，模型組滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力、細(xì)胞內(nèi)MMP-2/9mRNA及蛋白水平均下降（均p<0.05），培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性下降（p<0.05），提示，模型組滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降。
　　3、ERK、JNK和p38磷酸化特異性抑制劑濃度：與對(duì)照組比較，模型組ERK、JNK和p38磷酸化水平均升高（均p<0.05）；而加入ERK、JNK、p38磷酸化抑制劑（濃度分別為50μM、50μM、4

7、0μM），模型組ERK、JNK和p38磷酸化水平均降低（均p<0.05）。
　　4、MAPK信號(hào)通路對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降的介導(dǎo)作用：JNK或p38磷酸化抑制劑可上調(diào)模型組細(xì)胞侵襲力（p<0.05）、細(xì)胞內(nèi)MMP-2/9 mRNA及蛋白水平、培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性（p<0.05）；ERK磷酸化抑制劑下調(diào)模型組細(xì)胞侵襲力、細(xì)胞內(nèi)MMP-2mRNA及蛋白水平、培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性（均p<0.05）。