MAPK信號通路對氧化應激誘導滋養(yǎng)細胞侵襲力下降的介導作用的體外研究.pdf

1、目的:
　　體外研究MAPK信號傳導通路對氧化應激誘導滋養(yǎng)細胞侵襲力下降的介導作用。
　　方法:
　?、俳⒆甜B(yǎng)細胞氧化應激模型：選用人早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo，以不同濃度H2O2孵育HTR-8/SVneo細胞12h，應用CCK-8法檢測細胞增殖情況，熒光探針DCFH-DA標記法檢測細胞內(nèi)ROS水平。然后采用下述方法驗證該模型：選擇合適濃度H2O2孵育細胞，Annexin V-FITC/PI雙標記流式

2、細胞術(shù)分析細胞早期凋亡水平，TBA法和NBT法分別檢測HTR-8/SVneo細胞勻漿中MDA濃度和SOD活性。②檢測氧化應激條件下滋養(yǎng)細胞侵襲力變化：H2O2孵育HTR-8/SVneo細胞24h，Matrigel侵襲實驗檢測細胞侵襲力；H2O2孵育細胞6h和12h，熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)MMP-2/9mRNA水平，Western Blot檢測細胞內(nèi)MMP-2/9蛋白水平，明膠酶譜實驗檢測細胞培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性。③確定ERK

3、、JNK和p38磷酸化特異性抑制劑實驗濃度：H2O2孵育HTR-8/SVneo細胞6h和12h，Western Blot檢測細胞內(nèi)ERK、JNK和p38磷酸化水平；分別用ERK、JNK和p38磷酸化特異性抑制劑孵育HTR-8/SVneo細胞1h，H2O2孵育細胞12h檢測細胞內(nèi)ERK、JNK和p38磷酸化水平。④分析MAPK信號通路對氧化應激誘導滋養(yǎng)細胞侵襲力下降的介導作用：分別用ERK、JNK和p38磷酸化特異性抑制劑孵育HTR-8/

4、SVneo細胞1h，H2O2孵育細胞24h檢測細胞侵襲力變化，H2O2孵育細胞12h檢測細胞內(nèi)MMP-2/9mRNA和蛋白水平變化以及細胞培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性變化。
　　結(jié)果:
　　1、造模：CCK-8實驗中，與對照組比較，模型組H2O2濃度分別為25μM、50μM、75μM、100μM時，細胞活力均無明顯變化（均p＞0.05）。熒光探針DCFH-DA標記法發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，H2O2濃度分別為25μM、50μM、

5、75μM時，細胞內(nèi)ROS水平均無明顯變化（均p＞0.05），H2O2濃度分別為100μM、250μM、500μM、1000μM時，細胞內(nèi)ROS水平均上升（均p＜0.05）。因此，H2O2濃度為75μM~100μM時均可在不影響細胞增殖的情況下誘導細胞氧化應激。本實驗選用100μMH2O2進行造模，與對照組比較，模型組細胞凋亡水平差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05），細胞勻漿MDA濃度和SOD活性均增加（p＜0.05），提示造模成功。

6、　　2、氧化應激條件下滋養(yǎng)細胞侵襲力變化：與對照組比較，模型組滋養(yǎng)細胞侵襲力、細胞內(nèi)MMP-2/9mRNA及蛋白水平均下降（均p<0.05），培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性下降（p<0.05），提示，模型組滋養(yǎng)細胞侵襲力下降。
　　3、ERK、JNK和p38磷酸化特異性抑制劑濃度：與對照組比較，模型組ERK、JNK和p38磷酸化水平均升高（均p<0.05）；而加入ERK、JNK、p38磷酸化抑制劑（濃度分別為50μM、50μM、4

7、0μM），模型組ERK、JNK和p38磷酸化水平均降低（均p<0.05）。
　　4、MAPK信號通路對氧化應激誘導滋養(yǎng)細胞侵襲力下降的介導作用：JNK或p38磷酸化抑制劑可上調(diào)模型組細胞侵襲力（p<0.05）、細胞內(nèi)MMP-2/9 mRNA及蛋白水平、培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性（p<0.05）；ERK磷酸化抑制劑下調(diào)模型組細胞侵襲力、細胞內(nèi)MMP-2mRNA及蛋白水平、培養(yǎng)上清中MMP-2/9酶活性（均p<0.05）。