慢性應(yīng)激與波動(dòng)性高糖誘導(dǎo)的大鼠胰島及INS-1細(xì)胞葡萄糖毒性.pdf

1、研究目的 胰島β細(xì)胞功能紊亂和外周組織胰島素抵抗是糖尿病發(fā)病機(jī)制中的兩個(gè)重要方面。糖尿病患者體內(nèi)的長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞合成及分泌胰島素功能受損，甚至誘導(dǎo)β細(xì)胞死亡，這被稱(chēng)之為“胰島β細(xì)胞葡萄糖毒性”。糖尿病時(shí)的血糖紊亂主要有兩種主要形式，即持續(xù)性高血糖和波動(dòng)性高血糖。許多體內(nèi)及體外研究已經(jīng)表明長(zhǎng)期持續(xù)性高糖可造成胰島β細(xì)胞的胰島素合成、分泌及基因表達(dá)受損，以及細(xì)胞死亡。但是，目前關(guān)于波動(dòng)性高糖對(duì)胰島β細(xì)胞功能毒性效應(yīng)的

2、研究尚屬少見(jiàn)。盡管在健康個(gè)體其體內(nèi)的血糖水平在生理情況下也存在和輕微的波動(dòng)，但是流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)在亞臨床期和臨床期的糖尿病患者體內(nèi)的血糖波動(dòng)的幅度和頻率較正常個(gè)體更為顯著。而且流行病學(xué)調(diào)查資料顯示血糖變異性是糖尿病患者死亡及血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)同對(duì)照組比較波動(dòng)性高糖孵育可顯著降低鼠胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞的胰島素分泌、胰島素含量及其基因表達(dá)。而且將體外分離的人類(lèi)胰島孵育于波動(dòng)性波動(dòng)高糖中，其葡萄糖刺激的胰島素分泌功能明

3、顯受損，甚至誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡。但是波動(dòng)性高糖造成胰島β細(xì)胞毒性影響的可能潛在機(jī)制目前尚知之甚少。隨著對(duì)胰島β細(xì)胞葡萄糖毒性研究的不斷深入，有越來(lái)越多不同的機(jī)制和通路被證實(shí)與長(zhǎng)期高糖損傷胰島β細(xì)胞功能有著密切的關(guān)聯(lián)，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激是目前此領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是胰島β細(xì)胞中的一個(gè)非常重要的細(xì)胞器，在多種細(xì)胞生物功能中發(fā)揮著作用，例如胰島素原的合成，翻譯后的折疊修飾，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)等。許多生理性或生化性

4、刺激可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。胰島β細(xì)胞含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，易受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的損傷。在生理情況下，適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可參與調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞合成及分泌胰島素，保持體內(nèi)的血糖穩(wěn)態(tài)。但是長(zhǎng)期高糖環(huán)境可誘導(dǎo)過(guò)度的和(或)長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，產(chǎn)生毒性效應(yīng)，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能紊亂。例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中的胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激酶.真核細(xì)胞翻譯起始因子2α(PERK-eIF2α)通路過(guò)度活化可通過(guò)誘導(dǎo)其下游因子如活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)和C/EB

5、P同源蛋白(CHOP)表達(dá)，從而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能受損及凋亡。此外，研究亦發(fā)現(xiàn)大鼠胰島β細(xì)胞胰島素含量和基因表達(dá)降低與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中另一條通路--肌醇需要酶(IRE1)信號(hào)分支過(guò)度激活密切相關(guān)。但是在波動(dòng)性高糖狀態(tài)下，胰島β細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是否也被過(guò)度激活，進(jìn)而惡化胰島β細(xì)胞功能損傷，關(guān)于此類(lèi)研究目前尚屬少見(jiàn)。此外，胰島β細(xì)胞中由于相對(duì)缺乏抗氧化酶，故對(duì)氧化應(yīng)激亦十分敏感?，F(xiàn)認(rèn)為氧化應(yīng)激是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞葡萄糖毒性發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)

6、重要機(jī)制。體內(nèi)及體外研究證實(shí)長(zhǎng)期血糖升高可顯著增加胰島β細(xì)胞中的活性氧簇(ROS)的生成，升高氧化應(yīng)激因子如丙二醛(MDA)、硝基酪氨酸、8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤(8-OHdG)等水平。ROS可通過(guò)影響胰腺十二指腸同源盒-1(PDX-1)基因表達(dá)及活性，誘導(dǎo)解偶聯(lián)蛋白2(UCP-2)表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種途徑最終導(dǎo)致了胰島β細(xì)胞功能受損。然而，波動(dòng)性高糖是否也可明顯誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞中氧化應(yīng)激，造成胰島β細(xì)胞功能紊亂，關(guān)于此類(lèi)研究報(bào)道目前較少見(jiàn)

7、。 因而，為探討波動(dòng)性高糖對(duì)胰島β細(xì)胞功能的毒性效應(yīng)以及可能性機(jī)制，本就采用大鼠胰島及β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞，將其孵育在波動(dòng)性高糖環(huán)境中72h，隨即觀察大鼠胰島及INS-1細(xì)胞的胰島素合成及分泌功能變化，以及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物水平的改變，如eIF2α、PERK、.ATF4、CHOP、ROS、8-OHdG以及硝基酪氨酸等。 研究方法 采用Ficoll-400梯度離心法在體外分離SD大鼠的胰島。將分離的

8、大鼠胰島及INS-1細(xì)胞隨機(jī)分為3組并孵育在含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中，即11.1mmol/l葡萄糖(對(duì)照組)；25.0mmol/l葡萄糖(持續(xù)高糖組)；11.1和25.0mmol/l葡萄糖(交替孵育，波動(dòng)性高糖組)，共72小時(shí)。隨即應(yīng)用放射免疫學(xué)方法檢測(cè)大鼠胰島及INS-1細(xì)胞的胰島素釋放功能及細(xì)胞內(nèi)胰島素含量。采用實(shí)時(shí)定量PCR分析方法測(cè)定胰島和INS-1細(xì)胞中insulin和PDX-1基因表達(dá)，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)如ATF4和CHO

9、P基因表達(dá)。Western Blot方法被用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子eIF2α和PERK蛋白的磷酸化水平。此外，細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)如8-OHdG和硝基酪氨酸的含量也被測(cè)定。最后，采用MTT分析方法評(píng)價(jià)了大鼠胰島和INS-1細(xì)胞的細(xì)胞活性。 結(jié)論：及意義 綜上所述，本研究結(jié)果表明同持續(xù)性高糖相比，波動(dòng)性高糖更容易造成嚴(yán)重的大鼠胰島和INS-1細(xì)胞的葡萄糖刺激胰島素分泌功能損傷，而且此毒性效應(yīng)是時(shí)間依賴(lài)

10、性的。此外波動(dòng)性高糖可導(dǎo)致胰島素含量、insulin及PDX-1基因表達(dá)以及細(xì)胞活性的降低。上述的胰島β細(xì)胞功能損傷可能與波動(dòng)性高糖導(dǎo)致的過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激密切相關(guān)。 目前，對(duì)于胰島β細(xì)胞葡萄糖毒性的概念一般被限定于長(zhǎng)期持續(xù)性高糖所造成的胰島β細(xì)胞功能損傷及細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)波動(dòng)性高糖亦可損傷胰島β細(xì)胞合成及分泌胰島素功能，甚至較持續(xù)性高糖更為嚴(yán)重。這有助于對(duì)胰島β細(xì)胞葡萄糖毒性的發(fā)生發(fā)展機(jī)制進(jìn)一步理解和認(rèn)識(shí)。此外，本研