痕量DDT與納米二氧化鈦協(xié)同誘導(dǎo)人胚肝細(xì)胞氧化應(yīng)激和遺傳毒性作用的研究.pdf

1、DDT是最早人工合成的有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑，早先用于滅蚊防瘧疾，戰(zhàn)后開(kāi)始廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。由于DDT化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，殘留期長(zhǎng)，到目前為止，土壤、水及動(dòng)物脂肪組織中仍能檢測(cè)到較高濃度的DDT及其代謝產(chǎn)物。大量研究表明DDT能夠引起人類染色體斷裂、白血病、肺癌等危害，國(guó)際癌癥研究署（IARC）已將其列為人類可能致癌物。常規(guī)的物理、化學(xué)、生物方法難以滿足凈化處理在技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上的要求，有機(jī)氯污染物的處理技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)。近些年發(fā)展了多項(xiàng)技術(shù)用于處理DD

2、T污染的土壤和地表水，隨著研究的深入，TiO2輔助的光催化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生并有了快速的發(fā)展。然而，關(guān)于光降解過(guò)程中的中間產(chǎn)物的毒性變化仍不清楚。本研究顯示了在模擬太陽(yáng)光光照12 h的過(guò)程中，中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的存活率和DNA損傷的影響逐漸降低。但是在光照條件不能滿足時(shí)，DDT與nano-TiO2共存的情況并未考慮。當(dāng)機(jī)體暴露在混合毒物時(shí)，共存的已知毒性的化合物在體內(nèi)的相互作用，常常是通過(guò)改變機(jī)體的功能狀態(tài)或代謝能力而實(shí)現(xiàn)的。它可發(fā)生在毒物攝入、

3、吸收、分布、代謝轉(zhuǎn)化、排泄等過(guò)程中，或是作用于同一靶器官而產(chǎn)生的相關(guān)作用效應(yīng)。因此，研究納米顆粒物與其它毒物之間的相互作用對(duì)評(píng)估人體健康效應(yīng)具有非常重要的實(shí)用價(jià)值。 通常情況下TiO2被認(rèn)為是相對(duì)低毒的化合物。但是近來(lái)大量研究顯示了TiO2對(duì)人體健康的不利影響。研究發(fā)現(xiàn)nano-TiO2較相同化學(xué)成分的大顆粒TiO2的毒作用更明顯。納米顆粒在理化性質(zhì)發(fā)生巨變的同時(shí)，其生物學(xué)效應(yīng)的性質(zhì)和強(qiáng)度也可能發(fā)生質(zhì)的變化。Nano-TiO2

4、刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)，引起炎癥反應(yīng)、DNA損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化。納米顆粒誘導(dǎo)損傷的機(jī)制尚不明確，但是跟炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)。納米材料具有大量的界面，具有很強(qiáng)的吸附能力，從而能對(duì)金屬離子或有機(jī)物產(chǎn)生吸附作用。當(dāng)納米材料大量進(jìn)入環(huán)境后，特殊的表面效應(yīng)使得其極易與環(huán)境中的多種污染物結(jié)合。DDT廣泛存在于環(huán)境當(dāng)中，可吸附到nano-TiO2的表面，與nano-TiO2相互作用，納米顆粒的理化性質(zhì)利于污染物的吸收，促使其穿越各種生物屏障。二者對(duì)機(jī)體可

5、能導(dǎo)致的各種健康效應(yīng)有何變化，至今尚無(wú)研究。 環(huán)境污染物一般都是痕量存在，因此本試驗(yàn)系統(tǒng)了解痕量nano-TiO2與環(huán)境常見(jiàn)污染物DDT的聯(lián)合作用所致健康效應(yīng)。本研究以體外培養(yǎng)的正常人類來(lái)源胚胎肝細(xì)胞（L-02細(xì)胞）為靶細(xì)胞，探究nano-TiO2與DDT聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞ROS生成、DNA斷裂損傷、染色體損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化等情況的影響，系統(tǒng)研究nano-TiO2與DDT聯(lián)合作用所致氧化應(yīng)激效應(yīng)。本文在以往DDT與nano-TiO2

6、的毒作用機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，用體外試驗(yàn)探討了二者之間的相互作用及可能的毒作用機(jī)制，進(jìn)一步完善光催化反應(yīng)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)，為nano-TiO2介導(dǎo)的光降解反應(yīng)的可行性提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步深入了解環(huán)境中納米金屬氧化物的健康效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究分為三個(gè)部分： 第一部分、納米二氧化鈦光催化降解DDT及中間產(chǎn)物的DNA損傷效應(yīng)研究 目的：觀察納米二氧化鈦（nano-TiO2）光催化降解DDT不同時(shí)段的中間產(chǎn)物對(duì)人胚

7、肝細(xì)胞株（L-02）毒性作用的變化。 方法：采用nano-TiO2光催化降解法處理DDT的水溶液12 h，初始濃度為50 μg/mL，取不同時(shí)段的中間產(chǎn)物染毒L-02細(xì)胞，染毒時(shí)間為24 h，檢測(cè)其對(duì)L-02細(xì)胞的存活率、DNA損傷效應(yīng)的影響。 結(jié)果：50 μg/mL的DDT能顯著降低細(xì)胞的存活率（P<0.05），并引起明顯的DNA損傷效應(yīng)（P<0.05）。不同時(shí)段的DDT中間產(chǎn)物處理后，在0 min、2 min、5

8、 min、10 min、30 min、40 min、50 min、1 h、1.5 h、2 h時(shí)間點(diǎn)L-02細(xì)胞的存活率與溶劑對(duì)照組比有顯著性差異（P<0.05），且隨著時(shí)間的增加存活率逐漸升高，在3 h以后的中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的存活率與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）。彗星試驗(yàn)顯示40 min之前的DDT降解產(chǎn)物具有顯著的DNA損傷作用（P<0.05），隨著時(shí)間的增加DNA損傷效應(yīng)逐漸減小，50min以后的中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的DNA損

9、傷效應(yīng)與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）。 結(jié)論：DDT對(duì)L-02細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和DNA損傷作用，但是隨著光降解反應(yīng)的進(jìn)行，DDT光催化降解產(chǎn)物的毒性逐漸降低。 第二部分、DDT聯(lián)合納米二氧化鈦協(xié)同誘導(dǎo)人胚肝細(xì)胞氧化應(yīng)激作用 目的：觀察DDT、納米二氧化鈦（nano-TiO2）單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)人胚肝細(xì)胞（L-02）內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量及氧化應(yīng)激能

10、力的影響。 方法：生長(zhǎng)良好的人胚肝細(xì)胞，分別加入0.001、0.01、0.1 μmol/L的DDT，0.01、0.1、1 μg/mL的nano-TiO2，以及上述各濃度的DDT和nano-TiO2聯(lián)合作用，二甲基亞砜（DMSO，1mL/L）為溶劑對(duì)照，將L-02細(xì)胞染毒24小時(shí)后，運(yùn)用DCFH-DA作為熒光探針，采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)DDT與nano-TiO2聯(lián)合作用下L-02細(xì)胞內(nèi)ROS含量，同時(shí)檢測(cè)L-02細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶

11、超氧化物歧化酶（SOD）、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）。 結(jié)果：1 μg/mL的nano-TiO2單獨(dú)作用可引起ROS增加（P<0.05）；0.01 μmol/L以上的DDT作用24h引起ROS增加（P<0.05）；nano-TiO2與DDT聯(lián)合作用細(xì)胞內(nèi)ROS水平較溶劑對(duì)照組有顯著升高（P<0.05）。與溶劑對(duì)照相比，0.1、1 μg/mL的nano-TiO2單獨(dú)作用使L-02細(xì)胞中抗氧化酶SOD活力顯著性降低（P<0.0

12、01，P<0.001）；0.1 μmol/L的DDT作用24h顯著降低SOD水平（P<0.001）；nano-TiO2與DDT聯(lián)合作用細(xì)胞內(nèi)SOD水平較溶劑對(duì)照組有顯著降低（P<0.05）。0.01、0.1、1 μg/mL的nano-TiO2單獨(dú)作用能明顯增加L-02細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量（P<0.05，P<0.001，P<0.001）；0.01、0.1 μmol/L的DDT可誘導(dǎo)MDA含量顯著增加（P<0.001，P<0.0

13、01）；二者聯(lián)合作用可促進(jìn)MDA的生成（P<0.05）。析因分析結(jié)果顯示兩種受試物混和染毒存在交互作用，反應(yīng)曲面模型提示二者之間的相互作用為協(xié)同作用（P<0.05）。在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，L-02細(xì)胞的SOD活力水平與ROS生成量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.86901，P<0.01），MDA含量與ROS生成量呈正相關(guān)（r=0.91175，P<0.01）。 結(jié)論：痕量DDT和nano-TiO2聯(lián)合作用可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞氧化應(yīng)激，使其脂質(zhì)過(guò)氧化

14、反應(yīng)增強(qiáng)、抗氧化作用降低；二者引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和抗氧化力下降有可能是導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷的影響因素。 第三部分、DDT與納米二氧化鈦對(duì)人胚肝細(xì)胞遺傳毒性的協(xié)同效應(yīng)研究 目的：觀察DDT、納米二氧化鈦（nano-TiO2）單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)人胚肝細(xì)胞株（L-02）DNA、染色體損傷的影響。 方法：生長(zhǎng)良好的人胚肝細(xì)胞，分別加入0.001、0.01、0.1 μmol/L的DDT，0.01、0.1、1μg/mL的n

15、ano-TiO2，以及上述各濃度的DDT和nano-TiO2聯(lián)合作用，二甲基亞砜（DMSO，1 mL/L）為溶劑對(duì)照，L-02細(xì)胞處理時(shí)間為24h；運(yùn)用堿性和中性兩種彗星試驗(yàn)和DNA氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG的含量檢測(cè)各組DNA斷裂損傷程度，對(duì)各染毒組進(jìn)行體外微核試驗(yàn)計(jì)算其微核率的改變。 結(jié)果：各濃度的nano-TiO2均不能引起DNA單鏈斷裂增加(P>0.05)；0.01μmol/L以上的DDT作用24h后DNA單鏈斷裂增加

16、（P<0.05）；二者聯(lián)合作用可促進(jìn)DNA單鏈斷裂損傷作用。而在中性彗星試驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組均無(wú)明顯的DNA損傷(P>0.05)。1 μg/mL的nano-TiO2使L-02細(xì)胞中DNA氧化損傷標(biāo)志物8-OHdG生成量顯著性增加（P<0.05）；0.001 μmol/L以上的DDT作用L-02細(xì)胞8-OHdG生成量顯著增加（P<0.05，P<0.001，P<0.001）；二者聯(lián)合作用可促進(jìn)8-OHdG的生成。各濃度的nano-TiO2均不能

17、引起微核率增加（P>0.05）；0.01μmol/L以上的DDT作用L-02細(xì)胞微核率明顯增加（P<0.001）；二者聯(lián)合作用可促進(jìn)微核率的增加。析因分析結(jié)果顯示兩種受試物混和染毒存在交互作用（P<0.05），反應(yīng)曲面模型提示二者的相互作用為協(xié)同作用（P<0.05）。在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，L-02細(xì)胞的DNA單鏈斷裂損傷程度與ROS生成量呈正相關(guān)（r=0.85838，P<0.01）；8-OHdG水平與ROS生成量呈正相關(guān)（r=0.8669