經(jīng)味覺(jué)通路的納米氧化鋅和納米二氧化鈦顆粒的中樞神經(jīng)毒性.pdf

1、目的：
　　1.舌體滴注納米氧化鋅和納米二氧化鈦兩種混懸液，探索納米顆粒能否通過(guò)味覺(jué)神經(jīng)通路進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)
　　2.評(píng)估舌體滴注的納米顆粒通過(guò)味覺(jué)神經(jīng)通路在動(dòng)物體內(nèi)沉積的含量
　　3.檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，評(píng)估納米顆粒的中樞神經(jīng)毒性作用
　　4.腦組織形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化分析，探索納米顆粒進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)對(duì)中樞神經(jīng)毒性的影響
　　5.采用水迷宮實(shí)驗(yàn)探索納米顆粒對(duì)大鼠空間記憶及學(xué)習(xí)認(rèn)知功能的影響本論文主要包括以下兩

2、章內(nèi)容:
　　第一章 納米顆粒通過(guò)味覺(jué)神經(jīng)通路進(jìn)入Wistar大鼠
　　材料與方法：
　　1.納米材料的表征
　　1)透射電子顯微鏡(TEM)觀察表面形貌
　　使用TEM觀察納米氧化鋅和納米二氧化鈦的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，計(jì)算納米氧化鋅和納米二氧化鈦的平均粒徑。
　　2)納米材料化學(xué)成分的分析
　　采用X線光譜儀(EDS)對(duì)納米氧化鋅和納米二氧化鈦進(jìn)行化學(xué)成分分析。
　　3)X射線衍射物相分析(XR

3、D)
　　采用XRD設(shè)備分析納米氧化鋅和納米二氧化鈦的晶相，在室溫下，采用Ni過(guò)濾的Cu-Kα射線進(jìn)行。
　　2.動(dòng)物模型的構(gòu)建及神經(jīng)和腦組織元素含量檢測(cè)
　　1)配液用天平分別稱量1.5 g的納米氧化鋅和納米二氧化鈦粉末，分別倒入裝有30mL無(wú)菌水的100 mL血清瓶中，用標(biāo)簽紙?jiān)谄可w上分別標(biāo)記為“納米氧化鋅”和“納米二氧化鈦”。使用漩渦混勻器大力混勻，溶液濃度為50 mg/mL。將裝有納米氧化鋅和納米二氧化鈦混懸液

4、的血清瓶放入水浴鍋進(jìn)行加熱，當(dāng)水浴鍋溫度達(dá)到85-100℃時(shí)，用天平分別稱量0.3 g羥丙基甲基纖維素(HPMC)按照1％的比例，分別加入到納米氧化鋅和納米二氧化鈦血清瓶中。
　　2)超聲混勻
　　將配置好的混懸液放入超聲機(jī)中，頻率調(diào)至95％，溫度調(diào)至40℃，超聲90min，反復(fù)多次超聲。每次給藥前將配置好的混懸液再次加熱，用漩渦混勻器大力混勻，瓶底無(wú)沉淀后，放入超聲機(jī)中超聲約30 min，直至藥物均勻分散，無(wú)沉積，無(wú)明顯團(tuán)

5、聚現(xiàn)象即可。
　　3)動(dòng)物的選擇
　　從南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)買體重為120-150 g的成年雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分組，其中納米氧化鋅組、納米二氧化鈦組、對(duì)照組各10只，要求大鼠身體健康，活動(dòng)度正常，毛發(fā)色澤及密度正常。
　　3.腦組織及神經(jīng)組織透射電子顯微鏡的檢測(cè)
　　分別提取納米氧化鋅組，納米二氧化鈦組和對(duì)照組大鼠的海馬，大腦皮層和神經(jīng)組織（鼓索），放入固定液中固定，然后取出包埋，切片，觀察組織中

6、是否存在納米顆粒，及組織的損傷情況。
　　結(jié)果：
　　1.表征結(jié)果顯示，納米氧化鋅和納米二氧化鈦顆粒純度高，無(wú)雜質(zhì)，粒徑為50 nm，制備的納米氧化鋅和納米二氧化鈦混懸液分散均勻，無(wú)明顯團(tuán)聚或沉淀。
　　2.采用ICP-MS檢測(cè)納米氧化鋅組Zn元素含量，納米二氧化鈦組Ti元素含量，與對(duì)照組的Zn元素和Ti元素分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)組織和腦組織（小腦，腦干，大腦皮層，海馬）的Zn元素和Ti元素明顯高于對(duì)照組，差異具

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.腦組織和神經(jīng)組織的TEM結(jié)果顯示，納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層均可見(jiàn)組織中有散在的納米顆粒沉積，部分細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài)改變，如線粒體腫脹、嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，核固裂，神經(jīng)元凹陷，胞質(zhì)空，板層松解，形成空泡，髓鞘軸漿萎縮，形成空泡，還可見(jiàn)自噬體、溶酶體形成。對(duì)照組未見(jiàn)明顯的納米顆粒沉積，細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài)良好。
　　第二章 納米顆粒通過(guò)味覺(jué)神經(jīng)通路入腦的神經(jīng)毒性
　　材料與

8、方法：
　　1.納米顆粒對(duì)腦組織的氧化應(yīng)激損傷
　　1)將冰凍的樣本取出，分別提取納米氧化鋅，納米二氧化鈦，對(duì)照組的腦組織0.2 g，生理鹽水稀釋，盡可能保證樣品在4℃環(huán)境中，使用組織勻漿機(jī)制備組織勻漿(1∶9 w/v)，約3-5次，每次間隔30-60 s，共約10 min，離心，轉(zhuǎn)速2500 r/min，收集上清液。
　　2)分別檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)的活性，丙二醛(MDA)的含量，還原型谷胱甘肽(GSH)的含

9、量，谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的含量，谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。根據(jù)說(shuō)明書添加相應(yīng)試劑。在96孔板上進(jìn)行種板，采用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。
　　3)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)
　　收集不同組大鼠的腦組織，制作組織勻漿后，提取總RNA，即刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT-PCR法檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因，如Dhcr7、Cyp51、Gsr、Nox1、Sod2、Nqo1、Fmo2表達(dá)水平的

10、改變。選擇大鼠的β-actin基因作為內(nèi)參。
　　2.腦組織形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化分析
　　1)將取出的腦組織固定，石蠟包埋，用切片機(jī)切片，切片厚度約4μm。
　　2)將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE)，正置光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變。
　　3)免疫組化分析，采用Ki-67觀察增殖細(xì)胞的存在，采用八羥脫氧鳥(niǎo)苷酸(8-OHDG)觀察DNA損傷情況，采用神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的存在，隨機(jī)

11、選擇大腦皮層和海馬組織的區(qū)域，進(jìn)行拍照（棕色）。
　　3.動(dòng)物行為學(xué)分析納米顆粒產(chǎn)生的潛在中樞神經(jīng)毒性
　　1)水迷宮為一個(gè)直徑約2.0 rn的圓鋼管混凝土，深度約80 cm，水溫基本恒定在26℃，填滿水后添加不透明的黑色墨水。水池分為四個(gè)象限:東北(NE)，東南(SE)、西南(SW)和西北(NW)。內(nèi)置一個(gè)圓形平臺(tái)（直徑10 cm），置于象限中央，水面高度控制在圓形平臺(tái)上方2 cm的位置。
　　2)記錄大鼠1-7 d

12、在水迷宮尋找平臺(tái)所用的時(shí)間和運(yùn)動(dòng)軌跡。
　　3)采用SPSS20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)定結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析和多元方差分析，進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)和不同組間的兩兩比較，檢驗(yàn)方差齊性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.納米顆粒對(duì)腦組織氧化應(yīng)激損傷的檢測(cè)
　　1)納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組SOD的活性均顯著低于對(duì)照組，提示組織抗氧化能力下降。納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組MDA的含量均顯著高于對(duì)照

13、組，提示組織出現(xiàn)了脂質(zhì)過(guò)氧化。納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組GSH，GSH-Px，GSH/GSSG的含量均顯著低于對(duì)照組，提示組織抗氧化能力下降，出現(xiàn)了氧化應(yīng)激損傷。
　　2)與對(duì)照組比較，兩組實(shí)驗(yàn)組Dhcr7表達(dá)顯著下調(diào)、Cyp51和Nqo1表達(dá)顯著上調(diào)、納米氧化鋅組Gsr和Fmo2表達(dá)顯著上調(diào)、納米二氧化鈦組Sod2表達(dá)顯著上調(diào)、兩組實(shí)驗(yàn)組Nox1表達(dá)水平無(wú)顯著性差異，提示組織氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平改變，可能出現(xiàn)了氧化應(yīng)激損傷

14、。
　　2.腦組織形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化分析
　　1)在正置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，HE染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中，可見(jiàn)組織松解，出現(xiàn)裂隙，細(xì)胞排列松散，對(duì)照組組織未見(jiàn)明顯異常，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組腦組織發(fā)生了一定程度的病理改變。
　　2)在正置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，Ki-67染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中，增殖細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組少;8-OHDG染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬

15、中，DNA損傷的細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組多;GFAP染色后的納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬中，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組多;說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組腦組織出現(xiàn)了損傷，細(xì)胞增殖能力下降，可能出現(xiàn)神經(jīng)退化。
　　3.納米顆粒產(chǎn)生的腦毒性對(duì)動(dòng)物行為學(xué)分析的影響
　　1)在第1、2、3、5、8d，納米氧化鋅組大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在第6d，納米氧化鋅組大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)并停留的時(shí)間明顯短于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　

16、　2)在第2、3、4、5、8d，納米二氧化鈦組大鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在第6d，納米二氧化鈦組大鼠經(jīng)過(guò)平臺(tái)并停留的時(shí)間明顯短于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3)與對(duì)照組比較，兩組實(shí)驗(yàn)組Sgk1、Drd2、Trappc4、Gnaq表達(dá)均顯著下調(diào)，提示腦組織學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的表達(dá)改變，可能具有中樞神經(jīng)損傷。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)對(duì)Wistar大鼠舌體滴注納米顆粒的方式給藥30d，納米顆?？稍谀X

17、組織中沉積。
　　2.采用氧化應(yīng)激試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組腦組織清除超氧陰離子自由基的SOD活性降低，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量升高，GSH，GSH-Px，GSH/GSSG下降，提示腦組織抗氧化能力下降，發(fā)生了氧化應(yīng)激的損傷。
　　3.組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大腦皮層和海馬組織松解，細(xì)胞排列松散，提示腦組織發(fā)生了病理改變。
　　4.免疫組化分析，納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組

18、大腦皮層和海馬組織細(xì)胞增殖能力下降，出現(xiàn)了DNA損傷，可能還有神經(jīng)退化。
　　5.氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平部分出現(xiàn)了上調(diào)或下調(diào)，說(shuō)明腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平改變，進(jìn)一步提示腦組織發(fā)生了氧化應(yīng)激損傷。
　　6.行為學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，納米氧化鋅組和納米二氧化鈦組大鼠的認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組下降，說(shuō)明納米顆粒引起了腦組織的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能的障礙。
　　7.學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因表達(dá)水平均出現(xiàn)了下調(diào)，說(shuō)明腦組織學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因