納米二氧化鈦顆粒穿越大鼠氣血屏障的電鏡研究.pdf

1、納米顆粒具有獨特的物理、化學(xué)和生物特性，越來越廣泛地被應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域中。它們在這些領(lǐng)域的應(yīng)用帶來了巨大的經(jīng)濟效益，但同時也產(chǎn)生潛在的生物安全性與環(huán)境安全性等問題而引起世界范圍的廣泛關(guān)注。已有研究結(jié)果顯示納米顆?？梢鸺毎x、凋亡、細胞周期、應(yīng)激反應(yīng)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)等一系列的毒性效應(yīng)。納米顆粒進入機體后可以轉(zhuǎn)運到各器官，包括大腦和心臟等重要生命器官。轉(zhuǎn)運可以是簡單的物理性移位，還可以發(fā)生溶解（溶解大多數(shù)主要是物理過程，

2、少數(shù)有化學(xué)變化）和蛋白結(jié)合等化學(xué)性過程。而多項研究結(jié)果表明納米二氧化鈦顆粒(nano-TiO2)易進入上皮和間質(zhì)部位，nano-TiO2在肺灌洗液中只有20％的在巨噬細胞中可以被檢出，提示大多數(shù)nano-TiO2顆粒在上皮細胞或轉(zhuǎn)運到間質(zhì)和循環(huán)系統(tǒng)，然而nano-TiO2顆粒究竟是如何被轉(zhuǎn)運的，現(xiàn)有的研究并沒有給出直接的證據(jù)。
　　研究目的：
　　利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察nano-TiO2顆粒是否可以直接穿越大鼠肺氣

3、-血屏障，從而由肺進入血循環(huán)。旨在為nano-TiO2的生物安全性評價、危險度管理以及納米材料在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供有益的資料，進一步促進納米技術(shù)和納米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。
　　研究方法：
　　本實驗采用大鼠支氣管灌注實驗探究nano-TiO2穿越肺氣血屏障的過程，具體觀察指標包括:①肺組織病理切片常規(guī)HE染色:觀察肺組織結(jié)構(gòu)改變及nano-TiO2顆粒在肺泡的組織大體（一般指肉眼可見的）分布;②應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察nano-T

4、iO2顆粒在肺泡的微觀分布及對肺泡超微結(jié)構(gòu)的影響，特別是對肺氣血屏障的作用，并結(jié)合X射線能譜儀定性nano-TiO2顆粒的存在;③利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)檢測灌注后大鼠靜脈血中nano-TiO2顆粒在不同時間點的含量變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.材料表征X-衍射和透射電鏡鑒定結(jié)果:試樣中銳鈦礦相和金紅石相的比例為80％∶20％，nano-TiO2材料均呈圓形晶體顆粒，測得其平均粒徑約為25nm。
　

5、　2.肺組織光鏡觀察結(jié)果:對照組，大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡間隔較薄，肺泡腔干凈，無明顯炎癥變化。Nano-TiO2灌注后2h組，肺組織無明顯病理性改變，肺泡完整但呈現(xiàn)皺縮，少量納米顆粒以團聚狀態(tài)沉積在肺泡內(nèi)表面，也有少量分布在肺泡隔。Nano-TiO2灌注后6h組，大量nano-TiO2顆粒團聚物分布在大鼠肺部的呼吸性細支氣管、肺泡管、肺泡囊、肺泡和肺間質(zhì);肺組織出現(xiàn)明顯充血、出血的病理性改變，肺泡腔內(nèi)有明顯的滲出和炎性細胞浸潤。Nano

6、-TiO2灌注后12h組，nano-TiO2顆粒團聚物在肺組織中的分布比6h組減少，但病理性改變更加明顯，部分肺泡完整性遭到破壞，肺泡結(jié)構(gòu)排列紊亂或肺實變，整個肺泡結(jié)構(gòu)幾乎不存在。Nano-TiO2灌注后24 h組，肺泡表面少見nano-TiO2顆粒沉積，間質(zhì)偶見小的團聚顆粒分布，肺泡充血消失，水腫減輕，肺泡也有所修復(fù)。
　　3.透射電鏡觀察結(jié)果:在灌注后6h，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量nano-TiO2顆粒大團聚物和鏈狀小團聚物，肺泡腔內(nèi)

7、游離巨噬細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，但胞質(zhì)中有大量無膜包被的nano-TiO2顆粒團聚物。在氣血屏障處，有些nano-TiO2顆粒團聚物粘附在肺泡上皮細胞上，有些nano-TiO2顆粒大團聚物已破膜進入氣血屏障的肺泡上皮細胞內(nèi)，有nano-TiO2鏈狀小團聚物跨越肺泡上皮細胞和基膜進入毛細血管內(nèi)皮。在灌注后12h，nano-TiO2在肺組織中分布與6h相似，可見nano-TiO2顆粒以不同方式穿越氣血屏障，進入毛細血管腔，鏈狀結(jié)構(gòu)團聚物是直接穿越

8、氣血屏障進入的，塊狀團聚物以破膜的形式穿越氣血屏障進入。在灌注后24 h，nano-TiO2顆粒大量進入肺間質(zhì)，肺泡隔明顯增厚，接觸nano-TiO2顆粒的細胞呈現(xiàn)細胞損傷，凋亡及壞死，細胞中出現(xiàn)大量空泡，細胞核縮小，線粒體腫大，脊散亂。在有nano-TiO2顆粒的Ⅱ型肺泡上皮細胞中生成大量板層小體，細胞表面微絨毛消失。
　　4.ICP-MS結(jié)果:與對照組相比，nano-TiO2顆粒氣管灌注組在各時間點(0、2、6、12、24和4

9、8 h)全血Ti元素均高于對照組，但灌注組不同時間點間比較并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1)本研究實驗條件下，25 nm粒徑的nano-TiO2顆粒支氣管灌注后能夠跨越氣-血屏障進入血液循環(huán)，其中小鏈狀結(jié)構(gòu)團聚物是以直接穿越氣血屏障進入毛細血管腔的，大塊狀團聚物則是以破壞氣血屏障的形式進入毛細血管腔的。
　　2)本研究實驗條件下，25 nm粒徑的nano-TiO2顆粒支氣管灌注后可造成肺充血、肺水腫、肺泡破壞和