熱休克蛋白90在HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激與適應(yīng)中的作用研究.pdf

1、研究背景 不斷變化的環(huán)境影響著所有生存在其中的有機(jī)體，使細(xì)胞受到來自內(nèi)部和外部的各種應(yīng)激和損傷。機(jī)體必須適應(yīng)環(huán)境的改變才得以存活，因此需要細(xì)胞基因組做出程序性的應(yīng)答，導(dǎo)致效應(yīng)蛋白質(zhì)的變化來滿足細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境改變的要求。氧化應(yīng)激，是由于ROS(reactiveoxygenspecies)產(chǎn)生和消除之間的不平衡引起的，會(huì)導(dǎo)致人體多種疾病和細(xì)胞損傷。不同強(qiáng)度的氧化應(yīng)激可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)兩條相反的應(yīng)答途徑：一條導(dǎo)致細(xì)胞死亡，另一條引起細(xì)胞短暫的

2、非致死性的生理改變，后者的主要特征是適應(yīng)和保護(hù)。預(yù)適應(yīng)是細(xì)胞或者組織在亞致死性應(yīng)激后對(duì)應(yīng)激的抵抗性。熱休克蛋白90(Heatshockprotein90,Hsp90)是熱休克蛋白家族中的一員，在應(yīng)激情況下，可以與細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)作用，與細(xì)胞損傷和保護(hù)密切相關(guān)。在氧化應(yīng)激和適應(yīng)中，Hsp90與應(yīng)激損傷和保護(hù)關(guān)系如何，是通過何種途徑發(fā)揮作用的，仍有待闡明。 目的 1.通過氧化應(yīng)激和預(yù)適應(yīng)建立HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激

3、適應(yīng)模型； 2.研究在氧化應(yīng)激和適應(yīng)條件下，HepG2細(xì)胞活性和細(xì)胞內(nèi)Hsp90表達(dá)情況； 3.建立穩(wěn)定的Hsp90α下調(diào)表達(dá)和Hsp90β高表達(dá)HepG2細(xì)胞株，探討不同Hsp90表達(dá)水平在氧化應(yīng)激下對(duì)細(xì)胞活性的影響。 方法 1.建立預(yù)適應(yīng)及氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞模型：將細(xì)胞分為對(duì)照組、預(yù)適應(yīng)組、氧化應(yīng)激組和預(yù)適應(yīng)后氧化應(yīng)激組。預(yù)適應(yīng)因素：50tmol/LH2O2，2h，普通培養(yǎng)基孵育24h，氧化應(yīng)激因

4、素：500μmol/LH2O2，24h。通過AO/EB雙染色法、MTT比色法和PI染色流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞在不同條件下的存活情況。 2.穩(wěn)定的Hsp90α下調(diào)表達(dá)和Hsp90β高表達(dá)HepG2細(xì)胞株的建立：進(jìn)行pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、提取和純化以及瓊脂糖凝膠電泳的初步篩選和測序鑒定，將重組的pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β質(zhì)粒以電穿孔法轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)

5、胞中，經(jīng)過G418篩選、傳代，建立穩(wěn)定的Hsp90α下調(diào)表達(dá)和Hsp90β高表達(dá)細(xì)胞株。并用蛋白質(zhì)免疫印跡法(western-blotting)檢測胞內(nèi)Hsp90表達(dá)變化，繪制轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長曲線。 3.應(yīng)用MTT比色法測定Hsp90α下調(diào)表達(dá)和Hsp90β高表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激處理后的細(xì)胞存活狀態(tài)的影響。 4.應(yīng)用western-blotting方法檢測對(duì)照組和轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在氧化應(yīng)激中Hsp90的含量變化。 結(jié)果

6、 1.AO/EB雙染色結(jié)果：各組細(xì)胞經(jīng)AO/EB雙染色后呈現(xiàn)不同的染色狀態(tài)：對(duì)照組細(xì)胞為正常梭形，呈均勻綠色熒光染色；預(yù)適應(yīng)組可見少量綠色濃染細(xì)胞；氧化應(yīng)激組可見大量綠色或紅色濃染凋亡細(xì)胞；預(yù)適應(yīng)后氧化應(yīng)激組凋亡細(xì)胞明顯少于氧化應(yīng)激組。 2.MTT比色法結(jié)果：MTT比色法測定細(xì)胞生存活力比較：對(duì)照組＞預(yù)適應(yīng)組＞預(yù)適應(yīng)后氧化應(yīng)激組＞氧化應(yīng)激組(P＜0.05)。 3.PI染色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果：PI染色流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡率比

7、較：氧化應(yīng)激組＞預(yù)適應(yīng)后氧化應(yīng)激組＞預(yù)適應(yīng)組＞對(duì)照。(P＜0.05) 4.重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳初篩：小量提取質(zhì)粒后，挑選重組質(zhì)粒；DNA測序鑒定結(jié)果提示目的基因片段正確插入；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的western-blotting的鑒定結(jié)果：轉(zhuǎn)染pSmycHSP90β質(zhì)粒的細(xì)胞蛋白表達(dá)條帶積分光密度高，轉(zhuǎn)染pSilencerHSP90α質(zhì)粒的細(xì)胞蛋白表達(dá)條帶積分光密度低，對(duì)照組細(xì)胞的蛋白表達(dá)條帶積分光密度介于前兩者之間。 5.轉(zhuǎn)

8、染pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β質(zhì)粒的細(xì)胞生長曲線與對(duì)照組相比，生長情況無差別。 6.Hsp90α下調(diào)表達(dá)和Hsp90β高表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激處理后的細(xì)胞存活狀態(tài)的影響：Hsp90α下調(diào)表達(dá)組的細(xì)胞生存活力大幅度下降(P＜0.01)，Hsp90β高表達(dá)組的細(xì)胞生存活力＜預(yù)適應(yīng)后氧化應(yīng)激組(P＜0.01)。 7.氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)Hsp90含量的western-blotting鑒定結(jié)果：各組光密度值比較：對(duì)

9、照組＞hsp90β高表達(dá)組＞預(yù)適應(yīng)組＞預(yù)適應(yīng)后氧化應(yīng)激組＞氧化應(yīng)激組＞hsp90α下調(diào)表達(dá)組。 結(jié)論 1.不同濃度H2O2作用于HepG2細(xì)胞產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)和氧化應(yīng)激現(xiàn)象，應(yīng)用小劑量H2O2作用于細(xì)胞可以保護(hù)細(xì)胞免受更大濃度H2O2帶來的損傷。 2.應(yīng)用電轉(zhuǎn)染法可以使pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 3.Hsp90β主要是細(xì)胞生理情況下的構(gòu)成型表達(dá)，在氧化