幾丁聚糖在鎘致HepG2細(xì)胞氧化損傷中作用及機(jī)制的研究.pdf

1、幾丁聚糖(chitosan)，化學(xué)名為2-氨基-β-1,4-葡聚糖，分子式為：(C6H11O4N)n，是從幾丁動物外殼、低等植物菌類、藻類以及高等動物的細(xì)胞壁中提取出來的一種含有大量陽離子的葡萄糖胺多聚體。1811年法國科學(xué)家Braconnot首先從蘑菇中提取出幾丁質(zhì)并將其命名為Fungine。1823年，法國科學(xué)家歐吉爾在甲殼動物的外殼中也提取出幾丁質(zhì)并命名為chitin。1859年，魯凱特將幾丁質(zhì)置于氫氧化鈉溶液中加熱，制得一種可溶

2、解于有機(jī)酸的物質(zhì)；1894年，安波索拉將魯凱特制備的這種物質(zhì)命名為幾丁聚糖(chitosan)并沿用至今。 自發(fā)現(xiàn)幾丁聚糖以來，對它的研究不斷深入。1977年在美國波士頓召開了由MitSeaGrandProgram主辦的第一屆國際幾丁質(zhì)·幾丁聚糖學(xué)術(shù)會議，首次集中探討了幾丁質(zhì)的生產(chǎn)、開發(fā)及利用狀況；1982年，第二屆國際幾丁質(zhì)·幾丁聚糖會議于日本召開；亞洲也于1994年和1996年先后召開了兩屆幾丁質(zhì)·幾丁聚糖學(xué)術(shù)會議，并深入探

3、討了幾丁聚糖在醫(yī)藥、生物、食品、紡織工業(yè)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護(hù)諸領(lǐng)域的應(yīng)用前景。近年來，隨著高分子科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程的發(fā)展，幾丁聚糖在醫(yī)學(xué)方面的研究日益增多，并因其具有多種生理調(diào)節(jié)功能而被譽(yù)為除糖、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素與礦物質(zhì)外人體必需之第六生命要素。 環(huán)境重金屬鎘污染對人體的影響具有時(shí)效長、危害大、不易降解等特點(diǎn)，其致突變和致癌作用引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并使得重金屬拮抗劑、解毒劑的尋找和開發(fā)成為環(huán)境衛(wèi)生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。中國環(huán)境

4、衛(wèi)生學(xué)界著名教授陳學(xué)敏先生通過深入研究硒和鍺拮抗環(huán)境重金屬鎘的作用機(jī)制，建立了一整套較為完善的重金屬研究方法和學(xué)術(shù)思想，并發(fā)現(xiàn)硒、鍺等解毒劑的安全劑量范圍很窄，用量稍大即引起毒副作用，從而大大限制了該類解毒劑的應(yīng)用。隨著研究領(lǐng)域的拓寬，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，幾丁聚糖對重金屬具有很強(qiáng)的吸附作用并將其用于環(huán)境重金屬污染的治理；Gyliene和Bhanoori通過研究發(fā)現(xiàn)，以幾丁聚糖作為鎘的生化吸附劑可有效促進(jìn)鎘的代謝和排除。盡管這些研究只是剛剛開始

5、，但已凸顯出幾丁聚糖作為環(huán)境重金屬解毒劑的潛在價(jià)值。 本研究在采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基并證實(shí)幾丁聚糖對羥自由基清除作用的基礎(chǔ)上，以氯化鎘染毒HepG2細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷模型，檢測幾丁聚糖對細(xì)胞活力、ROS水平的影響，深入探討幾丁聚糖對DNA氧化損傷和損傷后修復(fù)的作用，以期初步闡明其作用機(jī)制。 第一部分幾丁聚糖對羥自由基的清除作用 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法研究幾丁聚糖對羥自由基的清除作用。以抗壞血酸作為陽

6、性對照，檢測不同濃度幾對聚糖對Fenton反應(yīng)體系中羥自由基的清除。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在0.04mg/ml-0.32mg/ml濃度范圍內(nèi)，幾丁聚糖聚對羥自由基(·OH)的清除作用逐漸增強(qiáng)，最大清除率可達(dá)93.67％；幾丁聚糖對羥自由基有假陽清除現(xiàn)象，扣除假陽清除率后，仍呈現(xiàn)74.98％-84.64％的清除率。研究表明幾丁聚糖具有較強(qiáng)的羥自由基清除作用。 第二部分幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細(xì)胞氧化損傷的作用及機(jī)制研究 1.幾丁聚

7、糖對氯化鎘致HepG2細(xì)胞活力降低的影響 采用MTT試驗(yàn)檢測氯化鎘對HepG2細(xì)胞的抑制作用及幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細(xì)胞活力降低的影響。 結(jié)果顯示：采用10μmol/L氯化鎘染毒HepG2細(xì)胞，其活力在所有染毒時(shí)間點(diǎn)(4h、8h、16h和24h)均無明顯降低；當(dāng)氯化鎘濃度增加至20μmol/L和30μmol/L時(shí)，染毒4h后，細(xì)胞活力均有一定程度的降低，但與正常對照組相比無顯著性差異；當(dāng)氯化鎘濃度增加至40μmol

8、/L和50μmol/L時(shí)，在所有染毒時(shí)間點(diǎn)上均可見細(xì)胞活力顯著降低(P＜0.05)固定染毒時(shí)間，HepG2細(xì)胞活力隨氯化鎘濃度的增加而降低，并呈現(xiàn)明顯的劑量-依賴關(guān)系。染毒時(shí)間為4h時(shí)，氯化鎘濃度由10μmol/L增加至50μmol/L，HepG2細(xì)胞活力從86.3％降至75.7％，僅40μmol/L和50μmol/L劑量組細(xì)胞活力與正常對照組有顯著性差異(P＜0.05)；當(dāng)染毒時(shí)間分別延長至8h、16h和24h，除10μmol/L劑量

9、組細(xì)胞活力與正常對照組間無顯著性差異外，其余染毒組細(xì)胞活力與正常對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。 20μmol/L氯化鎘染毒HepG2細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力降至54.8％；在培養(yǎng)液中加入高濃度的幾丁聚糖(0.5mg/ml)，細(xì)胞活力未發(fā)生顯著性變化(與正常對照組相比：P＞0.05)；在氯化鎘染毒的同時(shí)，于培養(yǎng)液中加入不同濃度的幾丁聚糖后，HepG2細(xì)胞活力隨幾丁聚糖濃度的增加而增強(qiáng)，并且最高劑量幾丁聚糖(0.5mg/m

10、l)與氯化鎘聯(lián)合作用組細(xì)胞活力與氯化鎘單獨(dú)作用組相比有顯著性差異(P＜0.05)。 2.幾丁聚糖對氯化鎘誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS的清除作用 研究不同濃度幾丁聚糖對氯化鎘誘發(fā)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS的清除作用。用氯化鎘誘發(fā)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生ROS，以DCFH-DA作熒光探針，采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測幾丁聚糖與氯化鎘聯(lián)合作用下HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：20μmol/L氯化鎘可使HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增

11、加(P＜0.01)；以0.50mg/ml幾丁聚糖處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平較正常對照組略有降低，但并無顯著性差異；與氯化鎘染毒組相比，幾丁聚糖和氯化鎘聯(lián)合作用組細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨幾丁聚糖濃度的增加逐漸降低，并且在高劑量幾丁聚糖(0.5mg/ml)和氯化鎘聯(lián)合作用組呈現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)表明，幾丁聚糖對HepG2細(xì)胞內(nèi)由氯化鎘誘發(fā)產(chǎn)生的ROS具有較好的清除作用。 3.幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細(xì)胞DN

12、A氧化損傷的影響 采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，以代謝酶較為完整的人肝腫瘤(HepG2)細(xì)胞為靶細(xì)胞，研究氯化鎘致HepG2細(xì)胞DNA氧化損傷作用及幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細(xì)胞DNA氧化損傷的影響。研究發(fā)現(xiàn)：(1)隨氯化鎘濃度的增加，HepG2細(xì)胞Olive尾矩值逐漸增大，并呈明顯的劑量-依賴關(guān)系；低濃度組(5μmol/L、10μmol/L)HepG2細(xì)胞Olive尾矩值與正常對照組相比無顯著性差異，但20μmol/L、40μmo

13、l/L和80μmol/L濃度組HepG2細(xì)胞Olive尾矩值均較正常對照組顯著增高(P＜0.01)；(2)幾丁聚糖對照組HepG2細(xì)胞DNA損傷較正常對照組略有減輕，但并無顯著性差異；分別以不同濃度幾丁聚糖與20μmol/L氯化鎘聯(lián)合作用時(shí)，HepG2細(xì)胞DNA損傷程度均較20μmol/L氯化鎘單獨(dú)作用組減輕，隨幾丁聚糖濃度的增加，DNA損傷逐漸減輕，呈現(xiàn)明顯的劑量-依賴關(guān)系；并且，在高劑量幾丁聚糖(0.50mg/ml)與氯化鎘聯(lián)合作用

14、組呈現(xiàn)極顯著性差異(P＜0.01)。研究結(jié)果表明，幾丁聚糖對氯化鎘致HepG2細(xì)胞DNA損傷有一定的保護(hù)作用。 4.幾丁聚糖對鎘抑制HepG2細(xì)胞DNA修復(fù)酶hOGG-1表達(dá)的影響 在以往開展的硒對鎘引發(fā)氧自由基清除作用和幾丁聚糖對羥自由基清除作用研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究幾丁聚糖對氯化鎘抑制HepG2細(xì)胞DNA氧化損傷修復(fù)酶hOGG-1表達(dá)的影響。在氯化鎘染毒HepG2細(xì)胞的同時(shí)，于培養(yǎng)液中加入不同濃度的幾丁聚糖，采用W

15、estemblotting檢測氯化鎘單獨(dú)作用以及幾丁聚糖和氯化鎘聯(lián)合作用下HepG2細(xì)胞DNA氧化損傷修復(fù)酶hOGG-1的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)以40μmol/L氯化鎘染毒HepG2細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)hOGG-1表達(dá)顯著下降(P＜0.01)；幾丁聚糖對照組與正常對照組相比，hOGG-1表達(dá)無顯著性差異；(2)不同濃度幾丁聚糖和氯化鎘聯(lián)合作用組HepG2細(xì)胞hOGG-1的表達(dá)水平均較氯化鎘單獨(dú)作用組高，隨著幾丁聚糖濃度的增加，hO