α-硫辛酸拮抗氯化鎘致HepG2細胞氧化損傷及再生谷胱甘肽的作用機制.pdf

1、鎘（cadmium）是一種重金屬環(huán)境污染物，自上個世紀以來,隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，鎘的生產和應用不斷增加，人類向環(huán)境中排放的鎘濃度已經遠遠超出了自然本底的鎘濃度。目前，我國鎘污染形勢非常嚴峻，環(huán)境鎘污染事件及其引起的疾病時有報道。由于鎘污染生物效應的多樣性和毒理機制的復雜性，對鎘毒性作用的研究一直是學術界的熱點研究課題。
　　鎘能對多種器官和組織造成損害，人體吸收過量的鎘可造成腎臟、肝臟、骨骼及睪丸損傷，甚至可引起癌癥。許多實驗研究

2、表明,鎘的毒性作用與氧化損傷密切相關。急性鎘中毒時，鎘引起的氧化損傷與細胞內谷胱甘肽（glutathione，GSH）的耗竭有關。目前對鎘中毒尚無特效藥治療，有研究提出利用抗氧化方案來緩解鎘中毒，如補充維生素E、GSH、乙酰半胱氨酸（NAC）和SOD強化刺梨汁等，均能減輕或抑制鎘中毒所導致的氧化損傷和肝、腎毒性。
　　α-硫辛酸（alpha-lipoic acid,α-LA）是一種理想的生物抗氧化劑，能有效地清除活性氧（react

3、ive oxygen species，ROS）、螯合金屬離子、再生其他內源性抗氧化物以及修復氧化損傷等。α-LA可以再生循環(huán)VitC、VitE、GSH、輔酶Q10等其他內源性性抗氧化劑，因此是抗氧化劑網絡中關鍵的組成部分。近年來，α-LA在糖尿病、缺血再灌注損傷、阿爾茲海默癥等疾病的治療及重金屬解毒方面受到學者的廣泛關注，其醫(yī)用價值正在得到逐步認可。GSH是一種重要的抗氧化劑，能夠清除體內的自由基，參與機體多種生化反應,阻止體內重要酶蛋

4、白巰基氧化。此外，GSH在提高機體免疫力、防止紅細胞溶血、解毒重金屬等方面也發(fā)揮重要作用。
　　因此，從α-LA再生GSH的角度,深入探討α-LA對鎘致人肝癌細胞HepG2氧化損傷的作用及α-LA再生GSH的機制至關重要，并為鎘致肝臟毒性及氧化損傷的防治措施提供新的學術思路。
　　第一部分、α-硫辛酸拮抗氯化鎘致HepG2細胞的氧化損傷
　　目的：探討α-LA干預鎘致HepG2細胞毒性的影響以及是否對其氧化損傷具有拮抗

5、作用。
　　方法：用單獨CdCl2（25μM）、α-LA（100μM）及聯合組（25μM CdCl2+100μMα-LA、25μM CdCl2+50μMα-LA、25μM CdCl2+10μMα-LA）處理HepG2細胞16 h。CdCl2染毒細胞前，聯合作用組按各自α-LA劑量預處理8h，其它組正常培養(yǎng)8h。采用四甲基偶氮噻唑藍（MTT）法檢測細胞活力，硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）含量，二硝基苯甲酸（DTNB）法

6、測定細胞內GSH含量及GSH/GSSG比值。
　　結果：CdCl2單獨染毒HepG2細胞16h后，與正常對照組相比，細胞活力顯著下降（P＜0.01），MDA含量明顯增加（P＜0.01），細胞內GSH含量及GSH/GSSG比值下降（P＜0.01）；α-LA干預后，與CdCl2單獨染毒組相比，細胞活力隨α-LA濃度的增加逐漸升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA水平在100μM和50μMα-LA作用后顯著下降（P＜0.05或P＜0

7、.01），細胞內GSH含量在100μM和50μMα-LA作用后顯著增加（P＜0.01），GSH/GSSG比值顯著性升高（P＜0.01）。
　　結論：α-LA可以減輕CdCl2對HepG2細胞的毒性作用，CdCl2損耗細胞內GSH，破壞細胞抗氧化防御系統的平衡，造成細胞一定程度的氧化損傷，α-LA干預使HepG2細胞內GSH含量增加，維持細胞內正常的抗氧化防御狀態(tài)，減輕CdCl2對HepG2細胞的氧化損傷。
　　第二部分、α-

8、硫辛酸再生GSH的作用機制
　　目的：探討α-LA再生GSH的機制。觀察α-LA是否通過調控GSH合成限速酶的表達來影響G SH的再生。
　　方法：染毒方法和實驗分組同第一部分。采用Western blotting和實時熒光定量PCR法測定HepG2細胞內GCLC和GCLM蛋白和mRNA的表達水平，采用熒光技術微量滴定板分析法測定γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（γ-glutamyl cysteine ligase，γ-GCL）酶活

9、力。
　　結果：CdCl2單獨染毒HepG2細胞16 h后，與正常對照組相比，γ-GCL酶活力、GCLC和GCLM蛋白和mRNA的表達水平顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）；α-LA干預后，與CdCl2單獨染毒組相比，γ-GCL酶活力、GCLC和GCLM蛋白和mRNA的表達水平明顯增加，且隨α-LA處理濃度的增加表達水平逐漸增加。
　　結論：α-LA通過上調GCLC和GCLM亞基 mRNA的表達，增加GCLC和GCLM蛋