α-硫辛酸再生谷胱甘肽的機(jī)制及Nrf2-ARE信號(hào)通路的作用研究.pdf

1、α-硫辛酸(α-LA)是一種有效的自由基清除劑和天然抗氧化劑，它能清除各種自由基；螯合金屬離子；再生其它抗氧化劑；再生和增強(qiáng)其它抗氧化酶的作用。由于α-LA具有多功能、強(qiáng)大、廣譜、再生其他抗氧化劑的特點(diǎn)，因此α-LA被譽(yù)為“萬(wàn)能抗氧化劑”。
　　鎘是一種常見的環(huán)境重金屬污染物，其在自然界具廣泛存在，具有“致癌、致畸、致突變”的作用，是自然環(huán)境中的一種重要毒物。許多研究表明，鎘誘導(dǎo)的各種疾病與氧化損傷密切相關(guān)，可以導(dǎo)致肝臟、腎臟、肺

2、部、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等產(chǎn)生氧化損傷性疾病。
　　谷胱甘肽是一種具有重要生理功能的天然活性肽，谷胱甘肽在自然界以氧化型谷胱甘肽(GSSG)和還原型谷胱甘肽(rGSH)兩種形態(tài)存在。rGSH在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護(hù)蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子氧化損傷方面具有重要作用。
　　因此，本研究從α-LA再生谷胱甘肽還原酶(GR)的角度，深入探討α-LA再生rGSH及拮抗鎘致HepG2細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制。為α-L

3、A作為一種潛在治療藥物應(yīng)用于鎘致氧化損傷性疾病的治療提供理論支持。
　　第一部分：α-LA拮抗鎘致HepG2細(xì)胞氧化損傷的作用
　　目的：探討α-LA對(duì)CdCl2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的作用。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，設(shè)一個(gè)正常組和五個(gè)處理組，分別為正常組（不施加任何處理因素）；25μMCdCl2單獨(dú)作用組；100μMα-LA單獨(dú)作用組；25μM CdCl2+10μMα-LA聯(lián)合作用組；25

4、μM CdCl2+50μMα-LA聯(lián)合作用組；25μM CdCl2+100μMα-LA聯(lián)合作用組。聯(lián)合作用組按上述α-LA劑量預(yù)處理8h，然后按上述分組中α-LA和CdCl2濃度進(jìn)行染毒處理，染毒時(shí)間為16h。用四甲基偶氮噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)Hep G2細(xì)胞的活力，用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。
　　結(jié)果：與正常組相比，25μM CdCl2單獨(dú)作用組細(xì)胞活力顯著降低（P<0.01）， ROS的水平顯著升高（P

5、<0.01）；與25μM CdCl2單獨(dú)作用組相比，α-LA（50μM,100μM）和25μM CdCl2聯(lián)合作用組的細(xì)胞活力顯著升高（P<0.01），α-LA（10μM，50μM，100μM）和25μM CdCl2聯(lián)合作用組中的ROS的水平均降低（P<0.01或P<0.05）。
　　結(jié)論：α-LA可以拮抗CdCl2致HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激，降低CdCl2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷。
　　第二部分：α-硫辛酸再生谷胱甘

6、肽機(jī)制的研究
　　目的：從谷胱甘肽還原酶（GR）催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）再生還原型谷胱甘肽（rGSH）的途徑，探究α-LA再生rGSH的作用機(jī)制。
　　方法：染毒方法和實(shí)驗(yàn)分組同第一部分。用rGSH和GSSG檢測(cè)試劑盒檢測(cè)rGSH的水平及rGSH/GSSG比值，用DTNB法檢測(cè)GR的酶活力，用Western blotting方法檢測(cè)GR的蛋白表達(dá)量，用PCR技術(shù)檢測(cè)GR的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與正常組相比

7、，25μM CdCl2單獨(dú)作用組rGSH水平及rGSH/GSSG比值顯著降低（P<0.01），GR酶活力降低（P<0.05），GR mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05），GR蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.01）；與25μM CdCl2單獨(dú)作用組相比，α-LA（50μM,100μM）與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中 rGSH水平及rGSH/GSS G比值顯著提高（P<0.01），α-LA（50μM,100μM）與25μM CdCl2聯(lián)合作

8、用組中GR酶活力提高（P<0.01或P<0.05），α-LA（10μM,50μM,100μM）與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中mRNA水平顯著提高（P<0.01），α-LA（50μM,100μM）與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中GR蛋白表達(dá)量顯著提高（P<0.01）。
　　結(jié)論：α-LA能夠誘導(dǎo)GR mRNA基因的表達(dá)，促進(jìn)GR蛋白表達(dá)量的增加，提高GR的酶活力，催化GSSG轉(zhuǎn)化為rGSH，促進(jìn)rGSH的再生。
　　第三

9、部分：Nrf2/ARE信號(hào)通路在α-硫辛酸再生谷胱甘肽中的作用
　　目的：探討Nrf2/ARE信號(hào)通路在α-LA再生rGSH中的作用。
　　方法：染毒方法和實(shí)驗(yàn)分組同第一部分。用Western blotting方法檢測(cè)檢測(cè)p-Nrf2和Nrf2的蛋白表達(dá)量，計(jì)算出p-Nrf2/Nrf2比值，用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法檢測(cè)α-LA對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響。
　　結(jié)果：與正常組相比，25μM CdCl2單獨(dú)作用組中p-Nrf2/N

10、rf2比值顯著降低（P<0.01）；與CdCl2單獨(dú)作用組相比，α-LA（10,50,100μM）與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中p-Nrf2/Nrf2比值顯著升高（P<0.01）。
　　在正常組中，被染色的Nrf2幾乎全部集中在細(xì)胞質(zhì)中；在25μM CdCl2單獨(dú)作用組和100μMα-LA單獨(dú)作用組中，被染色的Nrf2大量分布在細(xì)胞質(zhì)中，少量分布在細(xì)胞核中；在α-LA（10，50μM）與25μM CdCl2聯(lián)合作用組中，被染色