Nrf2-ARE信號(hào)通路在鑭所致神經(jīng)毒作用中的作用研究.pdf

1、目的:稀土元素（rare earth elements，REEs）包括輕稀土元素，以鑭、鈰為代表和以釔、镥為代表的重稀土元素。鑭(Lanthanum，La)，緣于其性質(zhì)活潑和在自然界中較為豐富被作為研究REEs毒作用的代表物質(zhì)。研究已經(jīng)表明REEs可經(jīng)口，呼吸道和皮膚吸收等途徑進(jìn)入機(jī)體，并在多種組織器官中蓄積。Feng的研究發(fā)現(xiàn)大鼠連續(xù)6w經(jīng)灌胃攝入氯化鑭（lanthanum chloride，LaCl3）(2 mg/kgBW/day)

2、后，海馬中的La含量為0.014±0.007μg/g。自孵化期E9至E16每日注射2 mg/kg LaCl3后，小雞大腦中的La可達(dá)0.029±0.011μg/g。仔鼠自孕期至斷乳后經(jīng)飲水染La(0.5％ LaCl3)后大鼠海馬中鑭含量接近0.04μg/g。據(jù)此，認(rèn)為鑭可穿透血腦屏障進(jìn)入大腦組織并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中蓄積。小劑量的稀土元素可引起hormesis效應(yīng)，然而高劑量可對(duì)機(jī)體多

3、系統(tǒng)多臟器造成損害，其中神經(jīng)系統(tǒng)相較于其他組織和器官更為敏感。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示居住于稀土礦區(qū)的兒童，其血REEs含量達(dá)2.18±1.08 ng/g時(shí)會(huì)表現(xiàn)出智商和認(rèn)知水平明顯下降，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，REEs可導(dǎo)致CNS發(fā)育缺陷。鑭暴露后小雞的長(zhǎng)期記億受到損傷。Morris water maze試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，亞慢性暴露于LaCl3的大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。以上的研究表明鑭具有明顯的神經(jīng)毒性。因此，隨著REEs的普遍應(yīng)用，

4、腦中累積的鑭對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害作用不容忽視，但其確切的機(jī)制至今仍不清楚。
　　有研究顯示LaCl3可造成原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷，而且LaCl3可誘發(fā)原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)。ROS水平過(guò)高是組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的一個(gè)重要標(biāo)志。核因子NF-E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid2-related factor,

5、Nrf2）-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路是組織細(xì)胞應(yīng)答氧化應(yīng)激反應(yīng)最重要的防御體系之一。一旦暴露于ROS，Nrf2就會(huì)與其胞漿內(nèi)抑制蛋白(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)解離，轉(zhuǎn)位入核，與小MAF蛋白結(jié)合形成異二聚體后再綁定于ARE序列，從而驅(qū)動(dòng)Nrf2依賴(lài)性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，這包括解毒酶類(lèi)和抗氧化酶類(lèi)基因。例如血紅素加氧合酶

6、1(haemeoxygenase1，HO-1)，依賴(lài)還原型輔酶醌氧化還原酶1(NADP(H): dehydrogenasequinone1，NQO1)，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthethase，γ-GCS），谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S transferase，GST)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathi

7、one peroxidase，GSH-Px)，谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)等，在神經(jīng)細(xì)胞抵御由化學(xué)毒物引發(fā)的氧化損傷方面發(fā)揮極為重要的作用。Nrf2-ARE信號(hào)通路活化可拮抗H2O2誘發(fā)的大鼠大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和壞死，增加神經(jīng)元對(duì)谷氨酸毒性的耐受能力，而Nrf2缺失或活化受抑的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)增加對(duì)化學(xué)毒物所致的氧化損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)和線(xiàn)粒體損傷的敏感性。更為有趣的是，有研究顯示Nrf2和其下游的信號(hào)分子

8、與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程有很大的相關(guān)性?；谝陨系难芯拷Y(jié)果，本次研究采用整體動(dòng)物與體外細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合的方法，應(yīng)用神經(jīng)行為學(xué)、組織病理學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等技術(shù)手段，從ROS生成水平，Nrf2-ARE信號(hào)通路活化狀態(tài)以及抗氧化酶的活性與、表達(dá)調(diào)控等不同層面探討鑭對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與Nrf2-ARE信號(hào)通路之間是否存在聯(lián)系，為進(jìn)一步闡明鑭的神經(jīng)毒作用機(jī)制，尋找有效干預(yù)的分子靶點(diǎn)提供更新的試驗(yàn)資料與科學(xué)依據(jù)。
　　研究方法:整體動(dòng)物試驗(yàn)，由實(shí)驗(yàn)

9、動(dòng)物中心（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)）提供的健康成年Wistar大鼠總計(jì)100只（雌性∶雄性=1∶1），體重260±10g，于動(dòng)物室飼養(yǎng)1w左右以適應(yīng)周?chē)h(huán)境。根據(jù)隨機(jī)化原則將雌鼠分為對(duì)照組和少，低，中，高劑量染鑭組，每組10只動(dòng)物。將雌性和雄性大鼠按照1∶1同籠進(jìn)行交配，次日清晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢有精子者記為妊娠第0d，然后孕鼠單籠飼養(yǎng)并自由攝水。各組子一代大鼠自出生后分別暴露于含0，0.125％ LaCl3，0.25％ LaCl3，0.5％

10、 LaCl3，1.0％ LaCl3的蒸餾水溶液。子代大鼠在斷乳前經(jīng)由吸吮母乳染鑭，斷乳后則通過(guò)自行飲水?dāng)z入相應(yīng)濃度的LaCl3蒸餾水溶液，至斷乳后2個(gè)月結(jié)束，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。采用Morris水迷宮測(cè)定仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，采用透射電子顯微鏡技術(shù)觀(guān)察仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，采用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，采用real time PCR法和western blot方法檢測(cè)仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Nrf2，NQO1，H

11、O-1，γ-GCS，GST，SOD，GSH-Px1，GR mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。
　　體外試驗(yàn)使用出生24 h之內(nèi)的wistar仔鼠進(jìn)行大腦皮層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）鑒定神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。采用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

12、，采用AnnexinⅤ/PI雙染測(cè)定細(xì)胞凋亡/壞死率，采用細(xì)胞免疫熒光法觀(guān)察Nrf2核轉(zhuǎn)位水平變化，采用real time PCR法和western blot方法檢測(cè)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2，NQO1，HO-1，γ-GCS，GST，SOD mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。使用Nrf2蛋白穩(wěn)定劑叔丁基對(duì)苯二酚(Tert-Butylhydroquinone，tBHQ)干預(yù)后，對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行再次測(cè)定，驗(yàn)證鑭所致氧化應(yīng)激與Nrf2-ARE

13、信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)及其對(duì)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的不利影響。
　　結(jié)果:1、LaCl3對(duì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)中，隨著染鑭劑量增加，仔鼠找到水下平臺(tái)的潛伏期和游泳距離逐漸增加;與對(duì)照組相比，仔鼠尋找平臺(tái)的路徑表現(xiàn)出雜亂，無(wú)目的性，用時(shí)增加，游泳距離增長(zhǎng)。在空間探索試驗(yàn)中，染鑭組仔鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越目標(biāo)象限的次數(shù)明顯低于對(duì)照組，搜索平臺(tái)策略目的性降低，甚至很少進(jìn)入目標(biāo)象限。2、LaCl3對(duì)仔鼠海馬神

14、經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。對(duì)照組仔鼠海馬內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較豐富，棒狀或球狀的線(xiàn)粒體分布于胞漿內(nèi)，豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)周?chē)街S多呈小顆粒狀的核糖體，高爾基體表現(xiàn)正常，多個(gè)扁平樣囊泡堆積，周?chē)⒉贾虼蠡蛐〉倪\(yùn)輸小泡，核膜邊緣光滑連續(xù)完整;染鑭組仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，線(xiàn)粒體均受到損傷，表現(xiàn)為數(shù)量減少，線(xiàn)粒體出現(xiàn)空泡樣變化，溶酶體內(nèi)內(nèi)體數(shù)量增多，核膜邊緣凹凸不平，核膜連續(xù)性受到損傷。3、LaCl3對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水

15、平，GSH含量，抗氧化酶活力的影響。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中，LaCl3可造成神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量產(chǎn)生，MDA水平增加，GSH含量減少，抗氧化酶活力減弱。4、LaCl3對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率/壞死率影響。體外實(shí)驗(yàn)中，隨著LaCl3處理濃度的增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率/壞死率逐漸增加。5、LaCl3對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路及其靶基因表達(dá)水平的影響。隨著染鑭劑量的增加，Nrf2及其靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)水平逐漸減少，明顯低于對(duì)照組。6、使用

16、Nrf2的穩(wěn)定劑tBHQ后，Nrf2信號(hào)通路被活化，促進(jìn)抗氧化酶活力表達(dá)，拮抗鑭對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用。
　　結(jié)論:1、鑭可使仔鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。2、體內(nèi)、體外試驗(yàn)中，鑭可使神經(jīng)細(xì)胞ROS、MDA水平增加，GSH含量減少，抗氧化酶活力降低。3、鑭可干擾Nrf2-ARE信號(hào)通路，下調(diào)其靶基因的表達(dá)水平。4、鑭可明顯影響神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，并使神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率/壞死率明顯升高。5、使用Nrf2的穩(wěn)定劑tBHQ，可活化Nrf2信號(hào)通路