丹參酮Ⅰ通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2-ARE信號(hào)通路在腎臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:探討丹參酮Ⅰ在腎臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:細(xì)胞實(shí)驗(yàn):1、利用不同濃度的丹參酮Ⅰ(TanshinoneⅠ，T-Ⅰ)處理人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，利用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞活力，檢測(cè)T-Ⅰ藥物毒性;2、利用不同濃度的H2O2處理HK-2，2h后檢測(cè)各組細(xì)胞活力，選取構(gòu)建氧化應(yīng)激模型最佳H2O2濃度;3、丹參酮Ⅰ藥效實(shí)驗(yàn):設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組1(control)、對(duì)照組2(T-Ⅰ)、模型組1(

2、H2O2)、模型組2(H2O2+T-Ⅰ)，利用丹參酮Ⅰ或其溶劑處理24h，然后H2O2組及H2O2+T-Ⅰ組利用過(guò)氧化氫處理2h，CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活力、流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法定量檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況;4、通過(guò)DCFH-DA法對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平在熒光顯微鏡下觀察;5、利用RT-qPCR及Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Nrf2及其下游基因表達(dá)情況;6、Nrf2敲降之后利用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)

3、Nrf2及其下游基因的表達(dá)，之后使用Nrf2-的HK-2重復(fù)丹參酮Ⅰ藥效實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各組細(xì)胞活力。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn):1、32只8周雄性ICR小鼠隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組1(sham)，假手術(shù)組2(sham+T-Ⅰ)，手術(shù)組1(IR)，手術(shù)組2（IR+T-Ⅰ），每組8只，sham+T-Ⅰ組及IR+T-Ⅰ組予以丹參酮Ⅰ腹腔注射兩周，sham組及IR組腹腔注射等量溶劑;2、建立腎臟缺血再灌注模型:手術(shù)組予以游離并夾閉左腎血管50min，切除右

4、腎;假手術(shù)組僅切除右腎，游離左腎血管，不阻斷血供;術(shù)后48h留取各組小鼠左腎組織及血清標(biāo)本;3、檢測(cè)血清肌酐(SCr)、尿素氮（BUN）水平，評(píng)估腎臟功能;4、腎臟組織切片HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)的改變，并進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分;5、檢測(cè)各組小鼠腎臟中SOD活力及MDA含量，評(píng)估氧化應(yīng)激狀態(tài);6、通過(guò)免疫組化觀察腎臟組織中CD8、IL-6的表達(dá)，評(píng)估各組小鼠腎臟的炎癥狀態(tài);7、Tunel法檢測(cè)各組小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡情況;8、利用RT-qPC

5、R及WesternBlot檢測(cè)各組小鼠腎臟中Nrf2及其下游基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果:細(xì)胞實(shí)驗(yàn):細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示3.5μM及更低濃度的T-Ⅰ對(duì)HK-2沒(méi)有細(xì)胞毒性，過(guò)氧化氫毒性試驗(yàn)顯示2mM為氧化應(yīng)激模型最佳處理濃度;T-Ⅰ藥效實(shí)驗(yàn):T-Ⅰ可顯著減輕H2O2導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞活力下降并且可以減少H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡;DCFA-DA活性氧檢測(cè)結(jié)果顯示T-Ⅰ可顯著減少H2O2誘導(dǎo)后的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平;信號(hào)通路研究發(fā)現(xiàn)T-Ⅰ可上調(diào)Nr

6、f2下游相關(guān)基因的mRNA以及蛋白水平，且能夠上調(diào)Nrf2在胞質(zhì)以及胞核的蛋白水平;且Nrf2敲降之后丹參酮Ⅰ不能改善H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn):T-Ⅰ可降低IR導(dǎo)致的小鼠血清肌酐、尿素氮升高，改善IR引起的腎臟組織病理學(xué)改變，且T-Ⅰ治療組小鼠腎臟炎癥狀態(tài)減輕、細(xì)胞凋亡減少;T-Ⅰ預(yù)處理可增加IR后腎臟組織內(nèi)SOD活力、降低MDA含量;信號(hào)通路研究發(fā)現(xiàn)T-Ⅰ可增加小鼠腎臟內(nèi)Nrf2表達(dá)及上調(diào)核內(nèi)Nrf2蛋白水平，