Nanoceria調(diào)控Nrf2-ARE轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的保護作用.pdf

1、1.研究背景和目的：
　　缺血心肌組織在重新恢復(fù)血流供應(yīng)時，再灌注能夠?qū)е滦募〖毎诮Y(jié)構(gòu)、功能等方面發(fā)生嚴重損傷，即臨床上常見的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。主要的生理病理學(xué)表現(xiàn)為心肌細胞會出現(xiàn)壞死以及細胞凋亡、線粒體功能發(fā)生障礙、心肌組織中脂質(zhì)過氧化物大量生成、并且能夠?qū)е滦募☆D抑(myocardial stunning)的臨床表現(xiàn)、再灌注后伴有心律失常產(chǎn)生、甚至發(fā)生心肌死亡等。近年來隨著

2、科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，心臟外科的治療技術(shù)也得到了很大的提升與改進，例如冠狀動脈溶栓術(shù)、心臟移植技術(shù)、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)等技術(shù)在臨床的廣泛開展應(yīng)用為患者帶來了新的希望，但是另一方面，由這些再灌注治療技術(shù)方法所帶來的心肌I/R損傷也成為了影響再灌注治療效果的主要負面影響因素及普遍的臨床問題。因此對于I/R損傷過程中心肌保護的研究一直是心血管領(lǐng)域重要的臨床與基礎(chǔ)性研究課題。
　　有研究表明，上調(diào)或激活抗氧化酶的表達、清除活性氧自由基等

3、抗氧化干預(yù)有利于減輕組織缺血再灌注損傷。二氧化鈰納米微粒(Nanoceria，CeO2)具有潛在的再生自由基清除能力和抗氧化酶活性。我們首次證實了Nanoceria具有抑制心肌氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的功能。本研究通過HE染色、TUNEL法、RT-PCR、Western Blotting等方法，探討Nanoceria對心肌氧化損傷的保護作用;并通過心肌缺血再灌注損傷動物模型實驗進一步研究Nanoceria能否提高心肌抗氧化能力、抗

4、細胞凋亡等功能。對于開發(fā)Nanoceria作為一種新型的抗氧化劑用于臨床防治自由基損傷和推動其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究具有重要意義。
　　2.材料方法：
　　2.1、本實驗中40只成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重250-300g，均由河南省實驗動物中心提供。隨機分為5組，每組8只。即假手術(shù)組（Sham組）、心肌缺血再灌注損傷模型組（I/R組）;1-10、10-25和50nm三種不同粒徑CeO2預(yù)處理組

5、（I/R+CeO2組）。Sham組和I/R組于術(shù)前24h經(jīng)尾靜脈注射PBS緩沖液(0.2ml/100g);各預(yù)處理組于術(shù)前24h經(jīng)尾靜脈注射CeO2納米懸液(0.2mg/100g)。
　　2.2、醫(yī)用水合氯醛（濃度為10％），對大鼠進行腹腔注射麻醉，每只大鼠給予的麻醉劑量按照300mg/kg的計量計算。大鼠意識喪失為麻醉成功的標(biāo)志，后將其以仰臥位固定在手術(shù)臺上。手術(shù)區(qū)備皮消毒，氣管插管并連接小動物呼吸機輔助呼吸，于胸骨左緣第四、五

6、肋間打開胸腔暴露心臟，用6-0proline手術(shù)線在實驗大鼠肺動脈圓錐和左心耳之間，距離主動脈根部大約3-4mm處穿線，當(dāng)大鼠心律基本規(guī)整以后，再用一帶有凹槽的乳膠管墊于血管和結(jié)扎線之間，對大鼠的冠狀動脈前降支進行結(jié)扎，結(jié)扎成功的標(biāo)志為當(dāng)位于結(jié)扎線遠端的心肌顏色先變白后變紫紺。計時心肌缺血45min末剪斷結(jié)扎線取出乳膠小管，恢復(fù)冠狀動脈血流，缺血部位心肌顏色恢復(fù)證明模型建立成功，再灌注的時長為120min。假手術(shù)組大鼠左冠狀動脈前降支只

7、穿線不結(jié)扎。
　　2.3、觀察實驗大鼠的心肌形態(tài)學(xué)變化是運用HE染色的方法對心肌標(biāo)本組織進行處理，后在光學(xué)顯微鏡下觀察。用TUNEL法檢測心肌凋亡細胞，計算心肌細胞凋亡率。
　　2.4、采用RT-PCR方法檢測凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax和Caspase-3)、Nrf2和抗氧化基因HO-1、NQO1的mRNA表達情況，用Western Blotting方法檢測Nrf2和抗氧化基因HO-1、NQO1的蛋白表達。觀察Nano

8、ceria預(yù)處理對心臟內(nèi)源性保護分子和凋亡相關(guān)蛋白的影響。
　　2.5、統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理分析實驗數(shù)據(jù)，所有計量資料均用(x)±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素的方差分析(one-way ANOVA)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義的定義為P＜0.05。
　　3.結(jié)果：
　　3.1、與Sham組比較，I/R組和I/R+CeO2各預(yù)處理組出現(xiàn)有明確的心肌缺血和心肌梗死區(qū)域;I/R+CeO2(10-25nm)組

9、心肌細胞損傷程度最輕，細胞凋亡率顯著低于I/R組(P＜0.01);I/R+CeO2各預(yù)處理組心肌細胞中Bcl-2mRNA表達水平較I/R組顯著提高(P＜0.01)，Bax和Caspase-3的mRNA表達水平較I/R組明顯降低(P＜0.01)。
　　3.2、Nanoceria促進心肌細胞Nrf2及其下游調(diào)控基因HO-1、NQO1mRNA表達量增加，與假手術(shù)組比較，模型組心肌細胞中Nrf2mRNA表達量只是略有升高，但是差異無顯著性

10、(p＞0.05)，說明I/R對于心肌組織中Nrf2的轉(zhuǎn)錄水平影響不大;下游抗氧化基因HO-1、NQO1mRNA表達量增加顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。與模型組比較，各實驗組中Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA表達量均有所增加(p＜0.01)，其中10-25nm粒徑組的轉(zhuǎn)錄水平最為明顯，這與Nanoceria預(yù)處理降低心肌細胞凋亡，抗氧化作用相一致。
　　3.3、使用Western Blotting方法檢測心肌組織胞漿

11、及細胞核內(nèi)Nrf2的蛋白表達情況，結(jié)果顯示Nanoceria預(yù)處理促進Nrf2入核及其蛋白表達。
　　4.結(jié)論：
　　4.1、Nanoceria納米顆粒能夠一定程度抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡作用，其中10-25nm的CeO2納米顆粒對心肌組織的保護作用最顯著?？沟蛲鰴C制可能與其上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2和下調(diào)促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達水平有關(guān)。
　　4.2、Nanoceria預(yù)處理可以使Nrf2