角膜基質細胞Nrf2-ARE信號通路活化缺陷在圓錐角膜發(fā)病中的作用.pdf

1、分類號：R772.23密級：不保密UDC：617學校代碼：11065碩士學位論文角膜基質細胞Nrf2ARE信號通路活化缺陷在圓錐角膜發(fā)病中的作用角膜基質細胞Nrf2ARE信號通路活化缺陷在圓錐角膜發(fā)病中的作用邊江邊江指導教師史偉云教授學科專業(yè)名稱眼科學論文答辯日期2015年05月22日摘要目的：目的：探討正常角膜和圓錐角膜基質細胞中氧化應激水平、Nrf2ARE信號通路活化的區(qū)別，及其對角膜基質降解酶表達水平的影響。方法：方法：1、收集2

2、012年11月至2013年6月在青島眼科醫(yī)院行角膜移植的圓錐角膜患者的角膜樣本，以及供體正常的旁中央角膜樣本，用Dispase和collagenase聯(lián)合消化法，組織塊分離培養(yǎng)正常角膜和圓錐角膜基質細胞，培養(yǎng)液均為DMEMF12（含10%胎牛血清），傳代限制在P4以內，采用200μMH2O2處理模擬氧化應激微環(huán)境。2、根據(jù)實驗需要設定不同培養(yǎng)條件，將正常角膜和圓錐角膜基質細胞分為4組：①正常角膜對照組（HCFCON）：正常角膜基質細胞常

3、規(guī)培養(yǎng)；②正常角膜氧化應激組（HCFH2O2）：采用200μMH2O2處理正常角膜基質細胞；③圓錐角膜對照組（KCFCON）：圓錐角膜基質細胞常規(guī)培養(yǎng)；④圓錐角膜氧化應激組（KCFH2O2）：采用200μMH2O2處理圓錐角膜基質細胞。3、細胞內活性氧自由基（Reactiveoxygenspecies，ROS）的活性采用DCFHDA熒光底物孵育法檢測。4、細胞核內Nrf2蛋白、Nrf2ARE信號通路下游抗氧化蛋白和尿激酶型纖溶酶原激活物

4、系統(tǒng)表達水平分別采用免疫蛋白印跡（Westernblot）法和實時定量PCR(RealtimeqPCR)方法進行檢測。5、細胞離心沉淀和培養(yǎng)基上清中基質金屬蛋白酶（MMPs）活性采用明膠酶譜技術檢測。結果：結果：1、正常培養(yǎng)條件下，圓錐角膜基質細胞中ROS熒光強于正常角膜基質細胞；經體外氧化應激刺激后，兩組ROS熒光強度均有增強，但圓錐角膜基質細胞中ROS熒光強度明顯強于正常角膜基質細胞。2、正常培養(yǎng)條件下，圓錐角膜基質細胞核內Nrf2

5、蛋白表達水平明顯高于正常角膜基質細胞（t=18.155P＜0.01）；在H2O2處理條件下，正常角膜基質細胞Nrf2核轉位表達水平明顯增高（t=50.867P＜0.01），但圓錐角膜基質細胞Nrf2核轉位表達水平受到抑制（t=62.123P＜0.01）。3、正常培養(yǎng)條件下，圓錐角膜基質細胞抗氧化基因還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化還原酶1（NQO1）、血紅素氧合酶1（HO1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）mRNA表達和蛋白表達水平顯著