角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2-ARE信號(hào)通路活化缺陷在圓錐角膜發(fā)病中的作用.pdf

1、分類號(hào)：R772.23密級(jí)：不保密UDC：617學(xué)校代碼：11065碩士學(xué)位論文角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2ARE信號(hào)通路活化缺陷在圓錐角膜發(fā)病中的作用角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2ARE信號(hào)通路活化缺陷在圓錐角膜發(fā)病中的作用邊江邊江指導(dǎo)教師史偉云教授學(xué)科專業(yè)名稱眼科學(xué)論文答辯日期2015年05月22日摘要目的：目的：探討正常角膜和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平、Nrf2ARE信號(hào)通路活化的區(qū)別，及其對(duì)角膜基質(zhì)降解酶表達(dá)水平的影響。方法：方法：1、收集2

2、012年11月至2013年6月在青島眼科醫(yī)院行角膜移植的圓錐角膜患者的角膜樣本，以及供體正常的旁中央角膜樣本，用Dispase和collagenase聯(lián)合消化法，組織塊分離培養(yǎng)正常角膜和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)液均為DMEMF12（含10%胎牛血清），傳代限制在P4以內(nèi)，采用200μMH2O2處理模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境。2、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)定不同培養(yǎng)條件，將正常角膜和圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞分為4組：①正常角膜對(duì)照組（HCFCON）：正常角膜基質(zhì)細(xì)胞常

3、規(guī)培養(yǎng)；②正常角膜氧化應(yīng)激組（HCFH2O2）：采用200μMH2O2處理正常角膜基質(zhì)細(xì)胞；③圓錐角膜對(duì)照組（KCFCON）：圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；④圓錐角膜氧化應(yīng)激組（KCFH2O2）：采用200μMH2O2處理圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞。3、細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（Reactiveoxygenspecies，ROS）的活性采用DCFHDA熒光底物孵育法檢測(cè)。4、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白、Nrf2ARE信號(hào)通路下游抗氧化蛋白和尿激酶型纖溶酶原激活物

4、系統(tǒng)表達(dá)水平分別采用免疫蛋白印跡（Westernblot）法和實(shí)時(shí)定量PCR(RealtimeqPCR)方法進(jìn)行檢測(cè)。5、細(xì)胞離心沉淀和培養(yǎng)基上清中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性采用明膠酶譜技術(shù)檢測(cè)。結(jié)果：結(jié)果：1、正常培養(yǎng)條件下，圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞；經(jīng)體外氧化應(yīng)激刺激后，兩組ROS熒光強(qiáng)度均有增強(qiáng)，但圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞中ROS熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞。2、正常培養(yǎng)條件下，圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2

5、蛋白表達(dá)水平明顯高于正常角膜基質(zhì)細(xì)胞（t=18.155P＜0.01）；在H2O2處理?xiàng)l件下，正常角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位表達(dá)水平明顯增高（t=50.867P＜0.01），但圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位表達(dá)水平受到抑制（t=62.123P＜0.01）。3、正常培養(yǎng)條件下，圓錐角膜基質(zhì)細(xì)胞抗氧化基因還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化還原酶1（NQO1）、血紅素氧合酶1（HO1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平顯著