Nrf2-ARE信號通路在癲癇腦損傷中的作用及萊菔硫烷的神經(jīng)保護機制研究.pdf

1、癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是多種病因?qū)е碌穆阅X部病變，以大腦神經(jīng)元過度地、反復超同步化放電為特征，臨床表現(xiàn)為短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的綜合征。癲癇反復發(fā)作可導致腦部神經(jīng)元選擇性損傷，甚至壞死丟失，從而引起膠質(zhì)細胞增生、突觸重構(gòu)等腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化;而大腦這些可塑性變化又使癲癇反復發(fā)作，是癲癇難治的主要原因之一，反復癲癇發(fā)作的患者常伴有認知功能損傷，其發(fā)生率約為30％-40％。
　　癲癇的發(fā)病機制非常復雜，迄今尚未完

2、全闡明，氧化應激損傷、谷氨酸興奮性毒性、鈣超載等多種因素都能誘導神經(jīng)元異常放電觸發(fā)癲癇。其中氧化應激產(chǎn)生的氧自由基連鎖反應是神經(jīng)元受損的核心病理環(huán)節(jié)。近年的研究結(jié)果證實，許多慢性疾病都與人體內(nèi)氧化應激發(fā)生，累積過多的自由基(Free Radical，F(xiàn)R)有關(guān)，癲癇與氧化應激之間的關(guān)系日益成為科研工作者研究的熱點。無論是癲癇動物模型還是癲癇患者的腦內(nèi)均存在著活躍的氧化應激反應，癲癇發(fā)作時FR含量明顯增加，遠遠超過機體對FR的清除能力。大

3、量的FR可以直接使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷，從而破壞細胞膜及其它細胞結(jié)構(gòu)，同時FR還能通過抑制線粒體功能引起細胞凋亡。因此，針對氧自由基在癲癇腦損傷病理機制中重要作用，抑制氧化應激和清除氧自由基可能是治療癲癇的重要策略。
　　轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(NF-E2-related factor2，Nrf2)是細胞氧化應激反應中的關(guān)鍵因子，通過與抗氧化反應元件(antioxidant responseelemen

4、t，ARE)相互作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達。Nrf2是機體調(diào)節(jié)抗氧化反應的重要轉(zhuǎn)錄因子，正常生理情況下位于細胞漿中，在細胞漿中與Keapl結(jié)合形成復合體，且被泛素蛋白酶迅速降解，從而保持其低活性的生理狀態(tài)。當機體受到氧自由基和內(nèi)源性毒素等攻擊后Nrf2與Keapl解離，其半衰期明顯延長，然后轉(zhuǎn)位進入細胞核，與抗氧化反應元件ARE結(jié)合后誘導抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表達。到目前為止，已證實經(jīng)Nrf2-ARE信號路徑調(diào)節(jié)的可編碼

5、內(nèi)源性保護基因超過200個。它們在增強組織抗氧化能力、保護組織細胞免受毒物損傷、抗腫瘤、抗炎癥和抗凋亡中起著重要的作用，其中血紅素氧合酶1(hemeoxygenase1，HO-1)和依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶1(NADPH:quinone oxidoreductase1，NQO1)是該通路編碼的重要的抗氧化酶。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)上調(diào)HO-1和NQO1的表達，能夠減少氧自由基和內(nèi)源性毒素對神經(jīng)元的毒性作用。既往研究證實，激活Nrf2-AR

6、E信號通路上調(diào)其基因產(chǎn)物的表達對神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、腦出血、腦梗死和腦外傷等，具有很強的神經(jīng)保護功能。但是，Nrf2-ARE信號通路在癲癇發(fā)病中表達改變，及其對海馬神經(jīng)元的保護作用還未見明確相關(guān)報道。
　　萊菔硫烷(Sulforaphane，SF)是一種廣泛存在于十字花科蔬菜的異硫氰酸鹽，具有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學特性，作為化學預防藥物已引起廣大研究者的關(guān)注。既往研究證實，SF是Nrf2-ARE信號通路重要的激活

7、劑，能夠誘發(fā)Nrf2磷酸化轉(zhuǎn)位入核，與ARE結(jié)合，正向調(diào)控抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達，清除自由基從而對機體細胞起到保護作用。但SF對癲癇的神經(jīng)保護作用及其具體分子機制尚未見明確報道。
　　本實驗主要采用杏仁核電點燃癲癇大鼠模型，觀察癲癇大鼠模型海馬組織中氧化應激參數(shù)（丙二醛和谷胱甘肽）的表達改變;Nrf2及其編碼的基因產(chǎn)物HO-1和NQO1的表達改變;同時進一步驗證以Nrf2-ARE信號通路為靶點的藥物SF對海馬組織氧化應激的改

8、善情況及對神經(jīng)元的保護作用。為闡明癲癇的病理生理機制提供實驗依據(jù)，同時為癲癇治療提供新的靶點，為抗癲癇藥物的選擇提供新的思路。
　　第一部分、Nrf2-ARE信號通路在急性電點燃癲癇大鼠海馬的表達及意義
　　目的:觀察急性電點燃癲癇大鼠海馬組織中氧化應激參數(shù)（丙二醛和谷胱甘肽）及Nrf2-ARE信號通路的表達改變，以期為癲癇的治療提供新的靶點。
　　方法:采用杏仁核快速電點燃制備急性癲癇大鼠模型（每天刺激20次，刺激間

9、隔時間10min，連續(xù)刺激2d，刺激電流為恒流，單向方波。），通過分光光度法檢測大鼠海馬組織中氧化應激參數(shù)（丙二醛和谷胱甘肽）表達改變;通過免疫組化和Western blot方法觀察Nrf2、HO-1和NQO1在海馬組織中蛋白水平的表達改變;同時通過Real-time PCR方法觀察Nrf2mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA在海馬組織中基因水平的表達改變。
　　結(jié)果:
　　1.氧化應激參數(shù)的改變:與對照組相比，

10、癲癇組大鼠海馬組織中谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量明顯降低(P＜0.01)。與對照組相比，癲癇組大鼠海馬組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平明顯升高(P＜0.01)。假手術(shù)組與對照組相比GSH與MDA差別無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.免疫組化結(jié)果:Nrf2免疫反應在海馬的錐體細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的胞漿和胞核均有表達;HO-1免疫反應主要在海馬錐體細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的胞漿。對三組大鼠

11、海馬CA1、CA2和CA3區(qū)Nrf2和HO-1表達的平均光密度值(AOD)測量，癲癇組比對照組AOD值明顯增高(P＜0.01);假手術(shù)組和對照組相比，AOD值差別無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.Western-blot結(jié)果:3.1、電點燃大鼠海馬組織胞核內(nèi)的Nrf2的表達明顯增強，而在對照組和假手術(shù)組Nrf2表達相對較弱，Nrf2與H3免疫印跡條帶相對吸光度比值電點燃組比對照組明顯增加，具有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.01

12、)。假手術(shù)組和對照組相比沒有明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。3.2、電點燃大鼠海馬組織胞漿內(nèi)的HO-1的表達明顯增強，而在對照組和假手術(shù)組HO-1表達相對較弱，HO-1與β-actin免疫印跡條帶相對吸光度比值，電點燃組比對照組明顯增加，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。假手術(shù)組的吸光度比值和對照組相比沒有明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4.Real-time PCR實驗結(jié)果:各組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1和NQO1mR

13、NA的表達水平以三種物質(zhì)mRNA/GAPDHmRNA表示，與對照組Nrf2、HO-1和NQO1mRNA表達水平相比，電點燃組Nrf2、HO-1和NQO1mRNA表達水平明顯增高，均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);假手術(shù)組Nrf2、HO-1和NQO1mRNA表達水平和對照組表達水平相比無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:急性癲癇發(fā)作可以導致海馬組織發(fā)生氧化應激，導致脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物MDA含量增高和自由基清除劑GSH含量降低

14、;急性癲癇發(fā)作可以誘導海馬組織中Nrf2和其編碼的基因產(chǎn)物HO-1和NQO1在蛋白和基因水平表達明顯增強。說明Nrf2-ARE信號通路與癲癇發(fā)病關(guān)系密切，可能是癲癇治療的新的靶點。
　　第二部分、萊菔硫烷對慢性電點燃癲癇大鼠的腦保護作用研究
　　目的:觀察萊菔硫烷對慢性電點燃癲癇大鼠的抗癲癇作用及對認知功能的影響;同時觀察其對海馬神經(jīng)元的保護作用。
　　方法:采用慢性杏仁核電點燃制備癲癇大鼠模型（每天電刺激1次，連續(xù)刺

15、激15d，刺激電流為恒流，單向方波。），在點燃過程中給予大鼠腹腔注射SF（5mg/kg/day）。通過對大鼠點燃過程中發(fā)作等級和后放電持續(xù)時間（afterdischarge duration，ADD）比較，觀察SF的抗癲癇作用;通過Morris水迷宮監(jiān)測癲癇大鼠的認知功能及SF對其的改善作用;通過尼氏染色和透射電鏡觀察癲癇大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學改變及SF的神經(jīng)保護作用。
　　結(jié)果:
　　1.SF對慢性癲癇模型點燃過程的影響在連

16、續(xù)給與15次亞驚厥電刺激的過程中，所有的大鼠均出現(xiàn)了不同程度的癲癇發(fā)作。連續(xù)15次電刺激后，在電點燃組中所有的大鼠均達到了完全點燃的標準（連續(xù)出現(xiàn)3次4-5級發(fā)作），而在電點燃+SF組的大鼠中僅有4只達到了點燃標準。對兩組大鼠的發(fā)作等級比較后發(fā)現(xiàn)在第9-15天的時候具有明顯的統(tǒng)計學差異（在第9-14天時P＜0.05，在第15天時P＜0.01）。同時，連續(xù)給予15次電刺激過程中所有大鼠的ADD逐漸延長，比較電點燃組和電點燃+SF組發(fā)現(xiàn)，在

17、第7-15天的時候具有明顯的統(tǒng)計學差異（在第9-10天時P＜0.05，在第11-15天時P＜0.01）。對照組和SF組沒有出現(xiàn)癲癇發(fā)作。
　　2.Morris水迷宮檢測結(jié)果
　　2.1 定位航行實驗結(jié)果:每日逃避潛伏期取其平均值進行比較，結(jié)果顯示，(1)對照組、電點燃組、SF+電點燃組和SF組四組大鼠的逃避潛伏期在第1和2天無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。在第1和2天，與對照組大鼠的逃避潛伏期相比較，電點燃組大鼠及SF+電點燃

18、組大鼠的逃避潛伏期均有延長趨勢。(2)實驗第3、4、5天，各組逃避潛伏期均比第1、2天有縮短趨勢，在第3、4和5天，與對照組大鼠的逃避潛伏期相比較，電點燃組大鼠的逃避潛伏期均明顯延長(P＜0.05);SF+電點燃組大鼠的逃避潛伏期較電點燃組大鼠均明顯縮短(P＜0.05)，但與對照組比較仍明顯延長(P＜0.05);SF組大鼠的逃避潛伏期和對照組沒有明顯變化(P＞0.05)。
　　2.2 空間探索試驗結(jié)果:電點燃組大鼠120 s內(nèi)穿越

19、平臺區(qū)域的次數(shù)明顯低于對照組(P＜0.01);SF+電點燃組大鼠120s內(nèi)穿越平臺區(qū)域的次數(shù)與電點燃組比較次數(shù)均明顯增多(P＜0.01)。在平臺象限的游泳時間為:與對照組相比，電點燃組明顯減少(P＜0.01)，SF+電點燃組在平臺象限的游泳時間與電點燃組比較明顯增多(P＜0.01)，SF組和對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.尼氏染色結(jié)果:對照組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)完整、核仁清晰，胞漿內(nèi)尼氏體豐富，錐體細胞排列規(guī)則緊密

20、，沒有明顯神經(jīng)元丟失;與對照組相比，電點燃組大鼠海馬神經(jīng)元丟失明顯，排列紊亂，可見細胞皺縮，染色質(zhì)凝集成塊、核固縮、尼氏體數(shù)量減少;SF治療后海馬組織神經(jīng)元邊緣清晰，神經(jīng)元沒有明顯丟失，結(jié)構(gòu)正常，僅少量染色質(zhì)凝集、尼氏體數(shù)量較癲癇組顯著增加。SF單獨用藥組海馬組織神經(jīng)元和對照組沒有明顯改變。
　　4.透射電極觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化:對照組電鏡觀察:神經(jīng)元形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰。胞核呈圓形，染色質(zhì)均勻分布。胞質(zhì)內(nèi)細胞器豐富，可見線

21、粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和大量的多核糖體。線粒體呈圓形或橢圓形，嵴清晰可見。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)達。軸突中神經(jīng)微絲微管清晰可見。突觸前、后膜結(jié)構(gòu)清晰，突觸前膜靠近突觸間隙一側(cè)有較多圓形的突觸囊泡，突觸間隙清晰。電點燃組電鏡觀察:海馬神經(jīng)元胞核腫脹、形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)減少分散，胞核疏松、透明，有些出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象。線粒體空泡化或均質(zhì)化。神經(jīng)微絲微管結(jié)構(gòu)不清，可見聚集。突觸前、后膜結(jié)構(gòu)模糊不清，突觸間隙增大，靠近突觸前膜的突觸囊泡

22、減少。SF+電點燃組電鏡觀察:海馬神經(jīng)元核膜完整，核形態(tài)基本正常，染色質(zhì)均勻分布，胞質(zhì)中細胞器形態(tài)基本正常，有髓神經(jīng)髓鞘完整。突觸數(shù)量較多，形態(tài)接近于正常。突觸前、后膜結(jié)構(gòu)清楚，突觸間隙清晰，突觸前膜的突觸囊泡較多。SF單組用藥組電鏡觀察和正常對照組超微結(jié)構(gòu)沒有明顯改變。
　　結(jié)論:本研究通過給慢性電點燃大鼠腹腔注射SF后發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗癲癇效果，同時對癲癇大鼠認知損傷也有一定的改善作用。進一步對癲癇模型海馬組織的大體形態(tài)和超微

23、結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，SF能有效防止癲癇發(fā)作對海馬神經(jīng)元的損傷。
　　第三部分、萊菔硫烷對慢性電點燃癲癇大鼠腦保護作用的機制研究
　　目的:觀察SF對癲癇大鼠海馬組織中氧化應激和對Nrf2-ARE信號通路及其基因產(chǎn)物HO-1和NQO1表達的影響，探討SF的腦保護作用機制。
　　方法:采用杏仁核慢電點燃制備慢性癲癇大鼠模型（每天電刺激1次，連續(xù)刺激15d，刺激電流為恒流，單向方波），同時在點燃過程中給予SF（5mg/kg/day

24、）腹腔注射，通過分光光度法檢測大鼠海馬組織中氧化應激參數(shù)（GSH和MDA）表達改變;通過Western blot實驗方法觀察Nrf2、HO-1和NQO1在海馬組織中蛋白水平的表達改變;同時通過Real-time PCR實驗方法觀察Nrf2mRNA、HO-1 mRNA和NQO1 mRNA在海馬組織中基因水平的表達改變。
　　結(jié)果:
　　1.氧化應激參數(shù)GSH和MDA含量比較與對照組相比，電點燃組大鼠海馬組織中GSH含量明顯降低

25、(P＜0.01);與正常對照組相比，電點燃組大鼠海馬組織中MDA水平明顯升高(P＜0.01)。SF治療后明顯升高了電點燃組大鼠海馬組織中GSH水平(P＜0.01)，明顯降低了電點燃組大鼠海馬組織中MDA水平(P＜0.01)。SF單獨用藥組與對照組相比MDA明顯降低(P＜0.01)， GSH明顯增高(P＜0.01)。
　　2.Western blot檢測Nrf2、HO-1和NQO1在海馬組織中的表達改變Nrf2蛋白表達水平以H3作為

26、參照，電點燃組大鼠與正常對照組相比，Nrf2水平?jīng)]有明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05); SF治療后可顯著升高癲癇大鼠海馬組織中Nrf2蛋白水平(P＜0.01);與對照組相比，單獨SF用藥組也使Nrf2蛋白表達水平明顯增高(P＜0.01)。
　　HO-1和NQO1蛋白表達水平以β-actin作為參照，癲癇組大鼠與正常對照組相比，HO-1和NQO1表達水平無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05);SF治療后可顯著增高癲癇大鼠海馬組織中HO-1和

27、NQO1蛋白水平(p＜0.01);與對照組相比，單獨SF組也使大鼠海馬組織中HO-1和NQO1蛋白表達水平明顯增高(P＜0.01)。
　　3.Real-time PCR檢測Nrf2、HO-1和NQO1mRNA在海馬組織的表達改變Nrf2、HO-1和NQO1mRNA表達水平以GAPDHmRNA作為參照。電點燃組大鼠與正常對照組相比，Nrf2mRNA、HO-1mRNA和NQO1mRNA水平?jīng)]有明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05); SF治療

28、后可顯著升高癲癇大鼠海馬組織中Nrf2mRNA、HO-1 mRNA和NQO1mRNA表達(P＜0.01);與對照組相比，單獨SF組也使大鼠海馬組織中Nrf2mRNA、HO-1mRNA和NQO1mRNA表達水平明顯增高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:SF能有效激活海馬組織中Nrf2-ARE信號通路，同時改善癲癇發(fā)作導致的氧化應激狀態(tài)，這可能是其腦保護的作用機制。該研究為闡明SF的神經(jīng)保護作用機制提供實驗依據(jù)，同時為抗癲癇藥物的選擇提供