蘇丹Ⅳ對(duì)HepG2細(xì)胞的遺傳毒性及氧化性DNA損傷.pdf

1、前言：蘇丹Ⅳ，又稱猩紅(Scarlet Red)，是一種人工合成的偶氮類、油溶性的化工染色劑，被大量地應(yīng)用在生物、化學(xué)等領(lǐng)域。雖然蘇丹Ⅳ是一種工業(yè)染色劑，但由于其鮮艷的顏色和不易褪色的特性，印度等一些國(guó)家還允許將蘇丹Ⅳ添加到辣椒粉中。 目前，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將蘇丹Ⅳ歸為第三類可致癌物質(zhì)，即現(xiàn)存證據(jù)不能就其對(duì)人類致癌性進(jìn)行分類。但其潛在致癌性引起食用蘇丹Ⅳ污染食物人群的恐慌。進(jìn)入體內(nèi)的蘇丹Ⅳ主要通過胃腸道微生物還原酶、

2、肝和肝外組織微粒體酶和細(xì)胞質(zhì)的還原酶進(jìn)行代謝，在體內(nèi)生成相應(yīng)的胺類物質(zhì)。多項(xiàng)體外致突變?cè)囼?yàn)和動(dòng)物致癌試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蘇丹Ⅳ的致突變性和致癌性與代謝生成的胺類物質(zhì)有關(guān)。蘇丹Ⅳ作為一種動(dòng)物致癌物，其致癌性已經(jīng)在兔、大鼠身上得到了證實(shí)。但其對(duì)人類的致癌性和誘導(dǎo)腫瘤的機(jī)制至今仍然是不明確的。 本研究選用的是一種代謝完全的人類來源的肝腫瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，它不僅保持了人正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的許多功能，還保留了一系列生物轉(zhuǎn)化過程中的Ⅰ相和Ⅱ相酶，是

3、檢測(cè)外來化合物遺傳毒性的理想細(xì)胞系。 本研究以HepG2細(xì)胞為試驗(yàn)系統(tǒng)，研究蘇丹Ⅳ的遺傳毒性及氧化性DNA損傷機(jī)制，以期為評(píng)價(jià)蘇丹Ⅳ對(duì)人類的致癌危險(xiǎn)性提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 方法：以HepG2細(xì)胞為檢測(cè)系統(tǒng)。用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)檢測(cè)DNA鏈斷裂，微核試驗(yàn)(MNT)檢測(cè)細(xì)胞染色體損傷。為了闡明蘇丹Ⅳ對(duì)HepG2細(xì)胞的遺傳毒性機(jī)制，我們用細(xì)胞內(nèi)2’，7-二氫二氯熒光素(DCFH-DA)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的濃度，用

4、免疫過氧化酶染色的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的水平。通過加入谷胱苷肽(GSH)合成抑制劑2-氨基4-(S-丁基磺酰亞氨)(BSO)和GSH合成前體物Ⅳ-乙酰半胱氨酸(NAC)，來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)GSH的水平，再經(jīng)蘇丹Ⅳ染毒，用SCGE技術(shù)測(cè)定此時(shí)HepG2細(xì)胞彗星尾部DNA％。最后，我們還用MTT試驗(yàn)檢測(cè)BSO預(yù)處理后蘇丹Ⅳ肝細(xì)胞毒性。 結(jié)果：25-100μM蘇丹Ⅳ與HepG2細(xì)胞接觸1h后，引起細(xì)胞內(nèi)DNA鏈的斷

5、裂，熒光顯微鏡下顯示細(xì)胞呈現(xiàn)彗星樣拖尾，其尾長(zhǎng)和尾部DNA的百分含量明顯增加，且呈劑量依賴關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)的微核發(fā)生率隨著蘇丹Ⅳ劑量的增加而增多，細(xì)胞內(nèi)微核發(fā)生率與對(duì)照組相比其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。50-100μM的蘇丹Ⅳ作用于HepG2細(xì)胞1h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平與對(duì)照組相比其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HepG2細(xì)胞與蘇丹紅IV接觸3h后，細(xì)胞內(nèi)8-OHdG表達(dá)水平在所有劑量組均比對(duì)照組明顯(P<0.05或P<0.

6、01)，且呈劑量依賴關(guān)系。BSO預(yù)處理后可使蘇丹Ⅳ對(duì)肝細(xì)胞DNA鏈斷裂更明顯，預(yù)處理后的各個(gè)劑量組尾部DNA(％)均比未預(yù)處理組的數(shù)值明顯增高，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而用NAC處理的HepG2細(xì)胞各劑量組尾部DNA(％)則明顯低于未處理組(P<0.05)。MTT試驗(yàn)顯示BSO預(yù)處理后可使蘇丹Ⅳ的肝細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)(P<0.05)。 結(jié)論： 蘇丹Ⅳ(25-100μM)可引起HepG2細(xì)胞DNA鏈斷裂和微核發(fā)