AαC誘導HepG2和A549細胞基因毒性及氧化應激作用研究.pdf

1、雜環(huán)胺是在煎炸、燒烤食品、煙氣及汽車尾氣中廣泛存在的一類有害物質。2–氨基–9–氫–吡啶并[2,3–b]吲哚（AαC），主要存在于卷煙煙氣中，其在主流煙氣中的釋放量約為60-258ng/支，由于 AαC是可疑的人體致癌成分（2B類致癌物），并且，吸煙會引起吸煙者AαC暴露量的顯著增加。因此，研究AαC的基因毒性作用對煙氣危害性評價具有重要意義。但以往研究主要集中在食物中含量較高的雜環(huán)胺，如，IQ、PhIP等，有關AαC的基因毒性研究較少

2、；已有研究表明一些雜環(huán)胺的基因毒性與其代謝活化和其誘導的氧化應激有關，而AαC誘導的氧化應激作用及其與基因毒性的關系并不清楚。本研究以人肝癌細胞（HepG2）和人肺泡上皮細胞（A549）作為模型，評估了AαC的基因毒性，并對氧化應激在基因毒性機制中的作用進行了研究，分析了AαC主要羥基化代謝產物，并探討了AαC羥基代謝活化對AαC誘導的氧化DNA損傷的影響。論文內容主要包括以下三部分：
　　一、以HepG2和 A549細胞為模型，

3、研究了AαC的基因毒性及氧化應激在其機制中的作用。實驗組用不同濃度的AαC對HepG2和 A549細胞染毒（HepG2細胞染毒劑量為5、10、15、20μg/ml，A549細胞染毒劑量為5、10、20、30μg/ml），對照組用0.1％DMSO進行染毒，采用凝膠電泳(SCGE)試驗檢測了細胞DNA損傷情況，對AαC的遺傳毒性進行了評價。以2’，7’–二氫二氯熒光素(DCFH)熒光探針法測定細胞內活性氧（ROS）水平；用 GSH/GSSG

4、比率測定試劑盒測定GSH/GSSG比率，評估了 AαC誘導的氧化應激效應；通過液相色譜串聯(lián)質譜（HPLC-MS/MS）測定8-羥脫氧鳥苷(8-OHdG)的水平，評估了DNA氧化損傷。結果表明： AαC作用細胞后，與未處理細胞相比，HepG2和 A549細胞 DNA斷裂的尾長，尾部DNA含量，Olive尾距顯著增高，并且細胞內8-OHdG水平的表達增強(P<0.05或0.01)；細胞內ROS水平比未處理細胞明顯增加（P﹤0.05或P﹤0.

5、01）；細胞內GSH/GSSG比率則明顯降低（P﹤0.05或P﹤0.01）。結果暗示，AαC使兩種細胞產生了氧化應激效應，并造成細胞DNA氧化損傷；8-OHdG水平與Olive尾距呈正相關（R2=0.746），暗示AαC對兩種細胞的基因毒性可能與ROS造成的氧化性DNA損傷有關。
　　二、為了探討 AαC羥基代謝活化在 AαC基因毒性中的作用，采用HPLC-MS/MS方法檢測對AαC在細胞中的羥基化代謝物進行了定性和相對定量分析。

6、結果表明：在HepG2和A549細胞孵育體系中，AαC的羥基化代謝產物均為5種，活化代謝產物1種，為N-OH-AαC，解毒產物4種，為6-OH-AαC、5-OH-AαC、4-OH-AαC、3-OH-AαC。但AαC在HepG2和A549細胞中各代謝產物的比例存在差異，活化代謝產物的比例分別為7.85%和31.54%，HepG2細胞中6-OH-AαC產物比例最高占總代謝產物的70.17%，在A549細胞中4-OH-AαC產物比例最高，占總

7、代謝產物的38.41%，；HepG2細胞中5種代謝產物的量均高于A549細胞，這可能是因為兩種細胞的酶活性存在差異。
　　三、為了探討AαC羥基代謝活化對AαC誘導的氧化DNA損傷的影響，以HepG2細胞為模型，用10和20μg/mL的AαC無血清培養(yǎng)基染毒，為了使系統(tǒng)具有不同的代謝活化能力，每個染毒劑量分別加入濃度為0、0.1、0.2、0.5、1mg/mLS9溶液，用HPLC-MS/MS對細胞羥基化代謝產物及8-OHdG含量進行