ABCG2基因遺傳變異對(duì)尿酸結(jié)石形成的機(jī)制研究.pdf

1、尿酸結(jié)石是泌尿系結(jié)石中一種常見的類型，其發(fā)病率在許多國家和地區(qū)出現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。尿酸結(jié)石形成的影響因素眾多但機(jī)制尚不明確，目前研究認(rèn)為高尿酸尿?qū)δ蛩峤Y(jié)石的形成起著至關(guān)重要的作用。尿液中的尿酸水平主要取決于腎小球的濾過與腎小管對(duì)它的分泌和重吸收之間的平衡，而腎小管對(duì)尿酸的分泌程度直接決定了尿尿酸水平的高低。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素是影響結(jié)石形成的眾多因素之一，多個(gè)基因已初步被證實(shí)與結(jié)石的發(fā)生存在密切關(guān)系。全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWA

2、S）表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族 G亞家族第2成員（ABCG2）基因存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)與高尿酸血癥、痛風(fēng)的發(fā)病相關(guān)聯(lián)。而 rs2231142（Q141K）是ABCG2第5個(gè)外顯子上的錯(cuò)義突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變與高尿酸血癥及痛風(fēng)的發(fā)生密切相關(guān)，尤其在男性表現(xiàn)更為明顯，但是該位點(diǎn)突變與尿酸結(jié)石形成的關(guān)系尚未見報(bào)道。
　　進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明 ABCG2基因敲除導(dǎo)致小鼠呈現(xiàn)出腎臟尿酸排泄量明顯增加，腸道排泄尿酸量減少，而體內(nèi)

3、血尿酸水平增加，這提示 ABCG2蛋白在腎外及腎性尿酸排泄過程中都發(fā)揮了重要生理作用。在我們前期實(shí)驗(yàn)中，通過沉默HK-2細(xì)胞ABCG2基因，我們發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞排泄尿酸能力明顯受損，且其他尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體并不能代償。由此我們推測 ABCG2基因表達(dá)的下調(diào)可能是導(dǎo)致腎臟細(xì)胞尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力的下降和尿酸分泌減少，繼而誘發(fā)高尿酸尿癥和尿酸結(jié)石形成的重要原因之一，但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　已有研究證實(shí)ABCG2基因的遺傳變異可導(dǎo)致ABCG2蛋白的表

4、達(dá)下降，進(jìn)而影響其尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能。因此，了解 ABCG2基因遺傳變異在尿酸結(jié)石人群中的分布情況，明確與尿酸排泄相關(guān)的SNPrs2231142位點(diǎn)突變?cè)诩?xì)胞水平及大鼠體內(nèi)對(duì)尿酸代謝和尿酸結(jié)石形成的影響，從而探明 ABCG2基因遺傳變異在尿酸結(jié)石形成過程中的作用及其可能機(jī)制，為臨床篩查尿酸結(jié)石易感人群和尿酸結(jié)石的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　1.比較尿酸結(jié)石病人及正常非結(jié)石體檢人群尿酸代謝相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的分

5、布，進(jìn)一步探索ABCG2基因SNP rs2231142位點(diǎn)突變與尿酸結(jié)石形成的關(guān)系；
　　2.分別構(gòu)建 ABCG2基因沉默 NRK穩(wěn)定細(xì)胞株、ABCG2穩(wěn)定過表達(dá)及Q141K位點(diǎn)突變的HEK-293細(xì)胞株，并檢測ABCG2基因沉默、過表達(dá)及Q141K位點(diǎn)突變?cè)诩?xì)胞水平上對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能影響；
　　3.采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建ABCG2基因敲除SD大鼠動(dòng)物模型，為下一步驗(yàn)證ABCG2蛋白在體內(nèi)對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)影響的機(jī)制研究奠

6、定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.以該院泌尿外科接受手術(shù)的尿酸結(jié)石患者及體檢中心無結(jié)石正常體檢人群為對(duì)象分別設(shè)立尿酸結(jié)石組及正常對(duì)照組，比較兩組人群一般資料，提取血液基因組DNA，并用質(zhì)譜法檢測尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)基因型，通過回歸分析研究兩組人群中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的SNP基因型分布以及相對(duì)應(yīng)的等位基因A、T與尿酸結(jié)石的發(fā)生的相關(guān)性。
　　2.設(shè)計(jì)合成四對(duì)Rat-ABCG2基因沉默序列（shRNA），

7、構(gòu)建ABCG2-shRNA重組表達(dá)載體瞬轉(zhuǎn)NRK細(xì)胞，并采用RT-PCR及Western blot檢測ABCG2表達(dá)變化，篩選出最高沉默效率的shRNA序列。將沉默效率最高的ABCG2-shRNA片段插入慢病毒表達(dá)載體pLKO.3G質(zhì)粒，構(gòu)建ABCG2沉默序列重組慢病毒質(zhì)粒pLKO.3G-shRNA。
　　3.提取SD大鼠組織RNA， PCR擴(kuò)增ABCG2基因CDS序列片段，并利用點(diǎn)突變的方法構(gòu)建ABCG2基因Q141K位點(diǎn)突變C

8、DS序列；分別將ABCG2基因CDS序列及突變CDS序列通過雙酶切法插入慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS質(zhì)粒，構(gòu)建 ABCG2過表達(dá)及點(diǎn)突變重組慢病毒質(zhì)粒 pLEX-ABCG2和pLEX-mutABCG2。
　　4.利用慢病毒包裝系統(tǒng)分別包裝 ABCG2基因沉默、過表達(dá)及位點(diǎn)突變慢病毒液，將攜帶 pLKO.3G-shRNA的慢病毒顆粒感染 NRK細(xì)胞；攜帶pLEX-ABCG2及pLEX-mutABCG2的慢病毒液分別感染HEK-29

9、3細(xì)胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株；通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測各組細(xì)胞外排尿酸鹽濃度，評(píng)估ABCG2基因沉默、過表達(dá)及Q141K位點(diǎn)突變對(duì)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。
　　5.利用CRISPR/Cas9基因靶向技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)目的基因ABCG2的gRNA，體外轉(zhuǎn)錄為mRNA，顯微注射法將gRNA/Cas9 mRNA混合物注入SD大鼠的受精卵中，并行胚胎移植至假孕雌鼠；對(duì)構(gòu)建的新生大鼠行基因測序鑒定，并傳代至產(chǎn)生ABCG2基因敲除的S

10、D大鼠。
　　結(jié)果：
　　1.本研究共納入尿酸結(jié)石患者166例，正常對(duì)照164例，兩組人群在性別、年齡方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但尿酸結(jié)石組患者血尿酸濃度明顯高于正常對(duì)照組。尿酸結(jié)石組SNP rs2231142發(fā)生位點(diǎn)突變的頻率高于正常對(duì)照組人群；尿酸結(jié)石組與正常對(duì)照組相比，A等位基因頻率有顯著性差異；相比CC基因型，CA基因型和AA基因型使尿酸結(jié)石發(fā)生的OR分別是2.58（95％CI:1.59~4.18, p<0.001）和4.7

11、6（95%CI:2.27~9.97, p<0.001）；A等位基因與尿酸結(jié)石發(fā)生顯著相關(guān)OR=2.93，（95%CI:1.85~4.66，p<0.001）。
　　2.半定量RT-PCR及Western blot分析發(fā)現(xiàn)pGP-sh1856瞬轉(zhuǎn)NRK細(xì)胞后， ABCG2基因mRNA及蛋白表達(dá)均明顯下降，提示ABCG2干擾序列sh1856有明顯的沉默效率。將該干擾序列通過雙酶切法與慢病毒表達(dá)載體pLKO.3G質(zhì)粒連接后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

12、電泳及測序證實(shí)連接正確。
　　3.成功釣取 Rat-ABCG2目的基因 CDS序列，并構(gòu)建 Rat-ABCG2基因CDS序列Q141K位點(diǎn)突變；通過雙酶切方法將Rat-ABCG2目的基因順利插入慢病毒表達(dá)載體pLEX-MCS質(zhì)粒，并成功將GFP基因片段連入重組表達(dá)質(zhì)粒。酶切后 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及測序鑒定證實(shí) pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　4.成功構(gòu)建ABCG基因沉默的NR

13、K細(xì)胞，熒光顯微鏡下表達(dá)GFP蛋白的NRK細(xì)胞>90%；RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示pLKO.3G-sh1856轉(zhuǎn)染組NRK細(xì)胞內(nèi)ABCG2 mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組NRK細(xì)胞明顯下降。液相色譜-質(zhì)譜對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液尿酸鹽濃度檢測發(fā)現(xiàn) pLKO.3G-sh1856轉(zhuǎn)染組 NRK細(xì)胞外排尿酸鹽濃度較對(duì)照組NRK細(xì)胞降低。
　　5.構(gòu)建成功的 ABCG2過表達(dá)及點(diǎn)突變 HEK-293細(xì)胞于熒光顯微鏡下觀察，表達(dá)GF

14、P蛋白的HEK293細(xì)胞>90%；RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2轉(zhuǎn)染組HEK293細(xì)胞內(nèi)ABCG2 mRNA和蛋白表達(dá)水平增高。液相色譜-質(zhì)譜檢測顯示pLEX-ABCG2、pLEX-mutABCG2轉(zhuǎn)染組HEK293細(xì)胞外排尿酸鹽濃度較對(duì)照組HEK293細(xì)胞明顯升高，且 pLEX-mutABCG2轉(zhuǎn)染組 HEK293細(xì)胞外排尿酸鹽濃度約為 pLEX-ABCG2轉(zhuǎn)染組50%，

15、兩組間差異顯著。
　　6.針對(duì)ABCG2第二個(gè)外顯子成功設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)gRNA及擴(kuò)增片段引物，經(jīng)顯微注射gRNA/Cas9 mRNA至受精卵雄性原核并胚胎移植孕育后，產(chǎn)生15只首建鼠，經(jīng)提取大鼠組織基因組 DNA，利用特異性引物 PCR擴(kuò)增后電泳及測序鑒定、篩選得到目的基因特定序列敲除的SD大鼠雜合子，合籠傳代至F2代時(shí)獲得目的基因ABCG2敲除的SD大鼠動(dòng)物模型。
　　結(jié)論：
　　1.人群中ABCG2 rs22311

16、42單核苷酸多態(tài)性與尿酸結(jié)石形成相關(guān)，且CA基因型、AA基因型及A等位基因與尿酸結(jié)石發(fā)生呈正相關(guān)。
　　2.成功篩選出具有顯著ABCG2沉默效果的shRNA序列，構(gòu)建了ABCG2基因沉默的NRK穩(wěn)定細(xì)胞株，說明pLKO.3G-ABCG2-shRNA可以下調(diào)NRK細(xì)胞內(nèi)ABCG2基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　3.成功構(gòu)建Rat-ABCG2及其Q141K位點(diǎn)突變的重組慢病毒表達(dá)載體，并順利構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Rat-ABCG2的H

17、EK293細(xì)胞株，說明pLEX-ABCG2慢病毒載體能上調(diào)HEK293細(xì)胞內(nèi)ABCG2基因mRNA及其蛋白的表達(dá)水平。
　　4. ABCG2基因沉默的NRK細(xì)胞尿酸鹽外排濃度下降，提示ABCG2基因沉默導(dǎo)致了其編碼蛋白的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙。
　　5. ABCG2過表達(dá)能顯著提高HEK293細(xì)胞外排尿酸鹽濃度，而ABCG2 Q141K位點(diǎn)錯(cuò)義突變可降低HEK293細(xì)胞尿酸鹽分泌濃度，提示ABCG2基因編碼蛋白對(duì)細(xì)胞尿酸鹽的分泌