魚精蛋白PRM基因遺傳變異及其對種公牛精液品質(zhì)的影響.pdf

1、種公牛在奶牛群的遺傳改良中起著關(guān)鍵性的作用，其精液品質(zhì)高低不僅是決定種公牛站經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素，更是影響奶牛受胎率的重要因素。公牛精液品質(zhì)性狀受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)和飼養(yǎng)管理等多種因素的影響。僅依靠營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理及常規(guī)育種的手段，來提高公牛的精液品質(zhì)性狀難度很大，且目標(biāo)周期長、效率低。公牛的精液品質(zhì)性狀屬于數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控，且精子發(fā)生過程復(fù)雜，篩選和精液品質(zhì)性狀相關(guān)的主效基因或關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)對于提高公牛的精液品質(zhì)性狀顯得極為重要。

2、>　　魚精蛋白在精細(xì)胞中是主要的核蛋白，與雄性生殖緊密相關(guān)，對精子的發(fā)育以及正常功能形成產(chǎn)生了重要的影響。鑒于此，本研究選擇魚精蛋白PRM基因(PRM1和PRM2)為候選基因，從基因轉(zhuǎn)錄形成的可變剪切體、基因的啟動子活性、功能性SNPs鑒定及其相關(guān)性分析等方面來研究這些遺傳變異對種公牛精液品質(zhì)性狀的影響，并嘗試分析影響公牛精液品質(zhì)性狀的分子調(diào)控機(jī)理。主要研究結(jié)果分述如下：
　　1.中國荷斯坦公牛PRM2基因多態(tài)性研究
　　中

3、國荷斯坦公牛PRM2基因的多態(tài)性的篩查是基于DNA直接測序和軟件比對技術(shù)進(jìn)行的，在外顯子2處檢測到一個錯義突變的新SNP g.+478 A>G，在編碼氨基酸時將精氨酸（R）錯義為甘氨酸（G）。本實(shí)驗(yàn)通過PCR-RFLP技術(shù)對g.+478 A>G位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并將各個基因型與公牛精液品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，g.478 A>G位點(diǎn)突變純合基因型GG的個體的采精量、鮮精活力、凍后活力和鮮精密度顯著高于野生純合型AA和雜合型AG(P

4、＜0.05)，畸形率也顯著低于二者(P＜0.05)。因此，GG型個體的精液品質(zhì)較好，GG可作為有利的分子標(biāo)記用于高繁殖力公牛的輔助選育。
　　2.中國荷斯坦公牛PRM2基因可變剪接體研究
　　為了研究PRM2基因可變剪切體在不同組織中的表達(dá)模式以及在大小公牛睪丸組織中的差異性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)檢測了PRM2基因總mRNA在不同組織中的表達(dá)，并采用qRT-PCR方法檢測PRM2基因兩個轉(zhuǎn)錄本即全轉(zhuǎn)錄本PRM2-C

5、T和可變剪切本PRM2-TV1在大小牛睪丸組織中的相對表達(dá)量。RT-PCR結(jié)果顯示，PRM2-CT和PRM2-TV1在大牛和小牛中均只在睪丸組織中有表達(dá)，在心臟組織、肝臟組織、脾臟組織、肺組織和腎臟組織中均不表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果表明PRM2-CT和PRM2-TV1在成年公牛睪丸中的表達(dá)量比小牛睪丸中的表達(dá)量高，且在大小公牛睪丸組織中均顯示PRM2-TV1的表達(dá)量顯著高于PRM2-CT表達(dá)量(P<0.05)。此外，該試驗(yàn)也說明PRM2

6、-TV1是轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的主轉(zhuǎn)錄本。
　　3.中國荷斯坦公牛PRM1基因啟動子和功能性SNP的鑒定
　　本試驗(yàn)通過生物信息學(xué)預(yù)測到PRM1基因存在一個啟動子區(qū)，且通過基因擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)在該啟動子區(qū)存在g.-138.A>G和g.-111.G>A2個SNPs，這兩SNPs位點(diǎn)呈現(xiàn)完全連鎖，因此可將其看作為一個整體SNP-1（g.-138.A>G）進(jìn)行遺傳研究。此外，還發(fā)現(xiàn)g.-138.A> G位點(diǎn)的突變可以使NF-Zc和H4TF-2轉(zhuǎn)

7、錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失，而以往的研究發(fā)現(xiàn)NF-Zc和H4TF-2結(jié)合因子具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的功能。通過PRM1基因啟動子區(qū)缺失片段的克隆，構(gòu)建出連接不同片段的含熒光素酶報告載體的質(zhì)粒，然后將這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)MLTC-1細(xì)胞中，根據(jù)測定的雙熒光素酶的活性來鑒定PRM1啟動子的核心區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRM1啟動子的核心區(qū)域存在于g.-230~g.-89片段之間，且上述兩個SNPs恰好均位于該核心啟動子區(qū)內(nèi)，同時也驗(yàn)證了SNPs g.-138.A>G

8、和g.-111.G>A降低了這個核心啟動子區(qū)的活性。RFLP-PCR對SNP g.-138.A>G進(jìn)行分型并對其與精液品質(zhì)關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)g.-138.A>G和g.-111.G>A位點(diǎn)中野生純合子的鮮精活力、凍精活力和鮮精密度高于突變純合子和雜合子，畸形率顯著比突變純合子和雜合子低(P<0.05)；這些顯著關(guān)聯(lián)表明 g.-138.A> G-A等位基因和g.-111.G>A-G等位基因可以提高鮮精子的活力。因此，這兩個SNPs可看

9、作選育中國荷斯坦公牛優(yōu)質(zhì)精液品質(zhì)性狀的潛在功能性分子標(biāo)記。
　　4.中國荷斯坦公牛PRM1基因可變剪接體研究
　　采用RT-PCR和基因測序方法鑒定PRM1基因是否存在可變剪切體，如有，就對各轉(zhuǎn)錄本在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測；進(jìn)而采用qRT-PCR方法，檢測在成年公牛和小公牛睪丸中不同剪切體的表達(dá)量。通過對基因測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)了一個新轉(zhuǎn)錄本（PRM1-TV1），該轉(zhuǎn)錄本缺少包含部分5’UTR和外顯子的片段共78 bp；RT-

10、PCR結(jié)果顯示：PRM1 mRNA在公牛組織中表達(dá)具備組織特異性。在成年公牛組織中，PRM1-CT在各組織中均表達(dá)且表達(dá)量較高，而PRM1-TV1僅在心臟和睪丸組織中表達(dá)且表達(dá)量較少；在小牛中，PRM1-CT在各組織中僅有微量的表達(dá)，但PRM1-TV1在各組織中幾乎不表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示：PRM1-CT和PRM1-TV1在兩個群體中表達(dá)量差異顯著，兩個轉(zhuǎn)錄本在成年公牛睪丸中的表達(dá)量比在小牛睪丸中高，并且PRM1-CT的表達(dá)量顯著