陜西省雞IBV的分離鑒定及其M蛋白基因的遺傳變異研究.pdf

1、近年來(lái)，雞傳染性支氣管炎己成為繼雞新城疫、雞馬立克氏病、雞傳染性法氏囊病之后又一嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的烈性禽病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。膜蛋白(Membrane proein，M)是IBV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。M蛋白含224～225個(gè)氨基酸，占病毒蛋白總量的40％左右。據(jù)其糖基化程度的不同分子量為23ku～36ku。它是一種N連接低聚糖。M蛋白的主要功能是與病毒的組裝、出芽有關(guān)，糖基化的M蛋白也與病毒的感染性相關(guān)，在補(bǔ)體存在的條件下也

2、能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生， M蛋白也可增強(qiáng)N蛋白的免疫性。因此，對(duì)IBV的M蛋白進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，可為雞傳染性支氣管炎的防治提供理論依據(jù)。本研究從陜西省發(fā)病雞群中分離出多株IBV，并對(duì)其M基因進(jìn)行了相關(guān)研究： 1.從臨床表現(xiàn)呼吸道傳染病的20個(gè)發(fā)病雞群中先后分離出18株病毒，通過(guò)雞胚感染、EID<,50>的測(cè)定、血清學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)試驗(yàn)以及動(dòng)物回歸試驗(yàn)，證明18株病毒中的13株是冠狀病毒科的雞傳染性支氣管炎病毒，3株為新城疫病

3、毒，2株為H9禽流感病毒。該13株中的BJ2、FF2、YL2、B01、G5、YX、WH、WG等8株分離毒具有很強(qiáng)的嗜腎陛和致病力。中和試驗(yàn)表明，8個(gè)腎型IBV分離株的血清型與W118毒株相同，而與IBV Gray株、W93株有一定的差異。試驗(yàn)證實(shí)了，近年來(lái)陜西地區(qū)主要流行雞腎型傳染性支氣管炎，且流行株具有強(qiáng)的嗜腎性和致病力。 2.參照GeneBank所收錄的IBV M蛋白基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)8株陜西腎型

4、IBV分離株的M基因進(jìn)行了擴(kuò)增，并構(gòu)建克隆載體，經(jīng)鑒定后將陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列及氨基酸序列同源性和進(jìn)化發(fā)生關(guān)系分析，對(duì)M蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，8分離株中除YX和WH株外，其余6株的M基因都有BamHI酶切位點(diǎn)；分離株間的M蛋白核苷酸和氨基酸同源性分別為92.3％～99.8％和95.4％～loo％，與參考毒株的M蛋白核苷酸和氨基酸序列同源性分別為87.4％～99.5％和89.4％～99.5％；分離株

5、與參考毒株M蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)都主要分布在N端前100氨基酸肽段區(qū)，其它的部分主要是β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；分離株的M蛋白都包含有3個(gè)跨膜區(qū)，主要分布在N端17～37，41～63，74～93aa肽段區(qū)。試驗(yàn)證實(shí)IBV分離株M蛋白在基因序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)上相對(duì)保守，M蛋白與IBV的血清型無(wú)關(guān)，但M蛋白可用于雞傳染性支氣管炎與其他疫病的鑒別診斷。 3.以陜西8個(gè)AIBV分離株M蛋白的基因序列為基礎(chǔ)，應(yīng)用DNAStar軟件中的MegAl

6、ign模塊對(duì)其進(jìn)行同源性分析；用Kyte-Doolittle方案、Jameson-Wolf方案、Karplus-schulz方案、Plot-Emini方案和Gamier-Robson方案對(duì)其中4個(gè)代表毒株的M蛋白B細(xì)胞抗原表位和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了綜合預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，分離株間以及它們與AIBVH52、M41、SAIB20、LX和Gray株的同源性相對(duì)較高，8株的M蛋白主要在10～40aa和90～175aa處存在無(wú)規(guī)律的點(diǎn)突變。4個(gè)代表株(W1

7、18、WH、YL2、YX)的M蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位都在159～164aa，和181～193aa肽段區(qū)(該2個(gè)區(qū)域都包含了無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu))或其附近。結(jié)果表明分離株的M蛋白相對(duì)保守，只存在無(wú)規(guī)則的點(diǎn)突變，該變異對(duì)AIBV M蛋白B細(xì)胞表位的穩(wěn)定性無(wú)影響。 4．以IBV陜西分離株G5(W118)作為研究材料，將所構(gòu)建的表達(dá)載體pET28a-M轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，通過(guò)表達(dá)條件的優(yōu)化探討M蛋白高效表達(dá)的方法，并應(yīng)用SDS-

8、PAGE和Western-blotting對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，目的蛋白在表達(dá)溫度為25℃、誘導(dǎo)劑工作濃度為0.5mM、卡那霉素工作濃度為80μg/mL、誘導(dǎo)前菌體OD<,600>≈1.5的條件下成功地得到了表達(dá)，融合蛋白的分子量為30.5Ku，蛋白表達(dá)量可占菌體蛋白總量的20％左右。這為IBV M蛋白的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 本研究通過(guò)對(duì)陜西省雞IBV的分離鑒定、M蛋白基因序列分析、M蛋白的B細(xì)胞抗原表位和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)