熱應(yīng)激下ERK1-2信號(hào)通路對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞乳酸合成的影響.pdf

1、熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物健康和生殖功能均有明顯的負(fù)面影響。哺乳動(dòng)物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了防止生精細(xì)胞過度凋亡而導(dǎo)致雄性不育的機(jī)制。睪丸支持細(xì)胞生成的乳酸不僅能為各級(jí)生精細(xì)胞提供營養(yǎng)，還能增加生精細(xì)胞抗凋亡的能力；ERK1/2信號(hào)通路、HSP70在熱應(yīng)激后細(xì)胞的生存反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。然而，熱應(yīng)激是否可以通過激活ERK1/2信號(hào)通路、增加HSP70的表達(dá)，促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞乳酸的生成目前還不清楚。因此，本試驗(yàn)以仔豬睪丸支持細(xì)胞為試驗(yàn)材料，43℃處理

2、培養(yǎng)的支持細(xì)胞30 min，通過添加信號(hào)通路的抑制劑和RNA干涉技術(shù)，探索磷酸化ERK1/2在熱誘導(dǎo)的乳酸合成中的作用，以及磷酸化ERK1/2與HSP70表達(dá)之間的關(guān)系。
　　本試驗(yàn)以21日齡的仔豬睪丸為試驗(yàn)材料，通過43℃培養(yǎng)箱處理睪丸支持細(xì)胞30 min模擬熱應(yīng)激環(huán)境，然后在32℃培養(yǎng)箱恢復(fù)不同時(shí)間（0，1，2，4，6 h）。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的活率；利用定量PCR檢測(cè)乳酸生成相關(guān)基因的表達(dá)，運(yùn)用western bl

3、otting檢測(cè)細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平和乳酸分泌相關(guān)蛋白的表達(dá)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液用乳酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行乳酸分泌量的測(cè)定。根據(jù)已確定的恢復(fù)時(shí)間，用U0126（ERK1/2信號(hào)通路抑制劑，處理2 h）和RNA干涉片段（處理6 h）處理細(xì)胞，分析HSP70、GLUT3和LDH A表達(dá)情況以及LDH活性及乳酸合成量。
　　試驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）熱處理結(jié)束后6 h內(nèi)，ERK1/2磷酸化水平均高于對(duì)照，但呈逐漸下降的趨勢(shì)，第4

4、 h開始，已經(jīng)與對(duì)照組并無顯著差異（P＞0.05）；HSP70蛋白表達(dá)和乳酸合成量在6 h內(nèi)則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)（P＜0.01），綜合考慮ERK1/2、HSP70蛋白表達(dá)和乳酸合成量，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇2h作為熱應(yīng)激后的恢復(fù)時(shí)間。
　?。?）不同濃度的U0126對(duì)細(xì)胞的存活率均有一定的影響，隨著其濃度的升高，細(xì)胞活性逐漸降低；當(dāng)濃度為5μM時(shí)，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.01）；1μM處能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)ERK1/2信號(hào)通路的激活

5、（P＜0.01），但對(duì)細(xì)胞活性無顯著影響(P＞0.05)。
　?。?）合成的ERK1 siRNA對(duì)ERK1 mRNA表達(dá)無顯著抑制作用（P＞0.05），而ERK2 siRNA顯著抑制ERK2 mRNA表達(dá)（P＜0.01）。因此選擇ERK2 siRNA來進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　?。?）與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激可以顯著促進(jìn)HSP70、GLUT3和LDH A的蛋白和mRNA水平的表達(dá)，增強(qiáng)LDH活性以及增加乳酸合成；在熱應(yīng)激處理之前，對(duì)細(xì)胞