ERK1-2信號(hào)通路對(duì)鈦合金顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞RANKL-OPG表達(dá)的影響.pdf

1、目的：1.研究鈦合金顆粒對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞增殖活性的影響；2.研究不同濃度鈦合金顆粒對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配基(Receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)及其餌受體骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG)表達(dá)的影響；3.研究細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase-1 and-2，ERK1/2)信號(hào)通路

2、在體外培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞RANKL和OPG表達(dá)中的作用。
　　方法：小鼠成骨細(xì)胞3T3-MC常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中(培養(yǎng)條件為37％，CO2濃度為5％)。選用第3代小鼠成骨細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h成骨細(xì)胞完全貼壁后作為研究用的成骨細(xì)胞。
　　實(shí)驗(yàn)1：實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(control)，鈦合金顆粒干預(yù)A組(0.01 g/L)、B組(0.1 g/L)和C組(1g/L)，每組6個(gè)樣本。在培

3、養(yǎng)第48h，采用CCK-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖活性。
　　實(shí)驗(yàn)2：實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(control)和鈦合金顆粒干預(yù)組(0.1g/L)兩個(gè)大組，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間又分為24h、48h、96h和168h四個(gè)亞組，每組6個(gè)樣本。分別在培養(yǎng)第24h、48h、96h和168h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用CCK-8法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖活性。
　　實(shí)驗(yàn)3：(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(control)和鈦合金顆粒干預(yù)組(0.1g/L)兩個(gè)大組，每組又分為0h、0.

4、5h、1h、3h和6h五個(gè)亞組。分別在培養(yǎng)第0h、0.5h、1h、3h和6h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用Western Blot法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)ERK1/2磷酸化水平。(2)實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(control)，鈦合金顆粒干預(yù)A組(0.01g/L)、B組(0.1g/L)和C組(1g/L)。在培養(yǎng)第0.5h，采用Western Blot法檢測(cè)不同鈦合金顆粒濃度作用下成骨細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平。
　　實(shí)驗(yàn)4：按照是否加用ERK1/2特異性抑制劑

5、(PD98059)，將成骨細(xì)胞分為無PD98059干預(yù)實(shí)驗(yàn)組和PD98059干預(yù)實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)大組，每大組又分為空白對(duì)照組(control)，鈦合金顆粒干預(yù)A組(0.01g/L)、B組(0.1g/L)和C組(1g/L))，再分為24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組6個(gè)樣本。分別在培養(yǎng)第24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收集各組細(xì)胞和培養(yǎng)基上清液，采用RT-PCR和ELISA檢測(cè)成骨細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基中RANKL和OPG的含量。
　　結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)1結(jié)果

6、顯示在不同濃度鈦顆粒共培養(yǎng)48h后，A組、B組成骨細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組成骨細(xì)胞增殖活性明顯低于對(duì)照組、A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　實(shí)驗(yàn)2結(jié)果顯示第24h、48h、96h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，鈦合金顆粒共培養(yǎng)組細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在96h內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞增殖活性逐漸增加，各時(shí)間點(diǎn)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但在第168h，鈦合金

7、顆粒干預(yù)組成骨細(xì)胞增殖活性低于對(duì)照組和96h實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2.實(shí)驗(yàn)3結(jié)果顯示在第0.5h，1h，6h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，鈦合金顆粒(0.1g/L)共培養(yǎng)組ERK1/2磷酸化水平均較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中0.5h亞組成骨細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化水平最高；但第3h時(shí)間點(diǎn)，兩組ERK1/2磷酸化水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同濃度鈦合金顆粒共培養(yǎng)的結(jié)果顯示，不同濃度鈦合金

8、顆粒組成骨細(xì)胞的ERK1/2磷酸化水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。
　　3.實(shí)驗(yàn)4
　　ELISA法結(jié)果顯示：
　　RANKL蛋白的表達(dá)：在不同濃度鈦顆粒共培養(yǎng)24h后，A組、B組和C組成骨細(xì)胞RANKL蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加，分別為A組：2520.5±100.82 ng/L、B組：3398.6±284.40 ng/L、C組：4698.2±276.79 ng/L和對(duì)照組：204.

9、8±23.95 ng/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。共培養(yǎng)48h后，A組、B組和C組成骨細(xì)胞RANKL蛋白的表達(dá)進(jìn)一步增加，分別A組：3566.1±251.58ng/L、B組：4536.1±259.14 ng/L和C組：6005.9±323.71ng/L，與對(duì)照組(261.8±34.44 ng/L)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而且隨著鈦合金顆粒濃度的增加，蛋白表達(dá)量越高，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PD98

10、059干預(yù)組成骨細(xì)胞RANKL蛋白的表達(dá)顯著低于無PD98059干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　OPG的分泌量：在不同濃度鈦顆粒共培養(yǎng)24h后，A組、B組、C組成骨細(xì)胞OPG的分泌量分別是341.9±21.12 ng/L、394.8±21.69 ng/L、370.3±26.41ng/L，和對(duì)照組(212.7±13.71 ng/L)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；共培養(yǎng)48h后，A組、B組、C組OPG的分泌的

11、量分別是436.1±12.29 ng/L、487.3±31.94ng/L、456.8±32.40 ng/L與對(duì)照組(279.6±22.18 ng/L)相比亦增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PD98059干預(yù)組成骨細(xì)胞OPG蛋白的分泌量較無PD98059干預(yù)組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　RANKL/OPG比值：各時(shí)間點(diǎn)，A組、B組和C組RANKL/OPG比值較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

12、1)；PD98059干預(yù)組RANKL/OPG比值較無PD98059干預(yù)組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：不同濃度鈦顆粒共培養(yǎng)24h、48h后，各組成骨細(xì)胞均有RANKL、OPG基因的表達(dá)；在各時(shí)間點(diǎn)A組、B組和C組成骨細(xì)胞RANKL和OPG基因的表達(dá)、以及RANKL/OPG比值均較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PD98059干預(yù)組成骨細(xì)胞RANKL、OPG基因的表達(dá)、

13、以及RANKL/OPG比值均低于無PD98059干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)條件下：
　　1.鈦合金顆粒可降低成骨細(xì)胞增殖活性，其作用與鈦合金顆粒濃度和作用時(shí)間相關(guān)。
　　2.不同濃度鈦合金顆粒可促進(jìn)成骨細(xì)胞RANKL、OPG的表達(dá)，尤其是RANKL的表達(dá)，同時(shí)也能上調(diào)RANKL/OPG的比值。
　　3.不同濃度鈦合金顆?？纱龠M(jìn)成骨細(xì)胞ERK蛋白磷酸化水平，激活ERK