PEMF調(diào)控Ca2+-Calcineurin-NFATc1信號(hào)通路抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化.pdf

1、目的:
　　本文首先進(jìn)行體外研究，采用小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞模型，添加細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator for nuclearfactor-kappa B ligand，RANKL)為刺激條件，誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化，因?yàn)轶w外實(shí)驗(yàn)具有直接可控的優(yōu)點(diǎn)，嘗試闡明下述問(wèn)題:第一，PEMF可否對(duì)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7破骨分化的過(guò)程產(chǎn)生抑制作用;第二，RAW264.7細(xì)胞

2、內(nèi)鈣離子信號(hào)在PEMF影響下的變化情況;最后，依據(jù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論，討論RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中PEMF的作用靶點(diǎn)，是否與抑制Ca2+-Calcineurin-NFATc1細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組
　　分別設(shè)置空白對(duì)照組（Control），RANKL單獨(dú)誘導(dǎo)組(RANKL)，低頻脈沖電磁場(chǎng)單獨(dú)照射組(PEMF)，RANKL誘導(dǎo)組+低頻脈沖電磁場(chǎng)(RANKL+PEMF)，RA

3、NKL誘導(dǎo)組+硝苯地平（RANKL+Nife），RANKL誘導(dǎo)組+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放阻斷劑(RANKL+SKF-96365)，RANKL誘導(dǎo)組+他克莫司（RANKL+FK506），RANKL誘導(dǎo)組+低頻脈沖電磁場(chǎng)+硝苯地平(RANKL+PEMF+Nife)，RANKL誘導(dǎo)組+低頻脈沖電磁場(chǎng)+他克莫司(RANKL+PEMF+FK506)檢查不同組破骨分化特異型標(biāo)志物、基因、蛋白及鈣離子表達(dá);
　　2.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
　　2.1 PEMF對(duì)

4、RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的影響
　　2.1.1 PEMF對(duì)RAW264.7細(xì)胞生物學(xué)特性的作用
　　應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)LEPMF(50Hz，1mT)對(duì)RAW264.7細(xì)胞分化過(guò)程中的影響。
　　2.1.2 破骨細(xì)胞分化基因蛋白的表達(dá)與檢測(cè)
　　傳代培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，RANKL(50ng/ml)，PEMF（置于37℃，5％二氧化碳孵箱中照射3h/d）刺激4天。TRAP染色實(shí)驗(yàn)

5、，骨片吸收陷窩實(shí)驗(yàn)，Western blot以及RT-PCR檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)條件下，破骨分化基因、蛋白以及特異性標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　2.2 PEMF對(duì)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)的影響
　　鈣離子熒光探針Fluo4-AM(10μM)，標(biāo)記RANKL刺激24h后的各組RAW264.7細(xì)胞，避光30min，激光共聚焦顯微鏡測(cè)定各組鈣離子變化情況。
　　2.3 PEMF對(duì)Ca2+-Calcineurin-

6、NFATc1破骨分化信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
　　采用試劑盒測(cè)定Calcineurin蛋白活性，加入特異性信號(hào)通路阻滯劑后上述手段檢測(cè)鈣離子變化、Calcineurin蛋白表達(dá)，NFATc1核轉(zhuǎn)位情況及破骨分化特異性蛋白組織蛋白酶K的表達(dá)。
　　3.統(tǒng)計(jì)分析
　　數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析其余數(shù)據(jù)，方差齊性時(shí)采用LSD法

7、，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。設(shè)置P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.PEMF抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化
　　1.1 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　我們發(fā)現(xiàn)，各處理組在破骨分化過(guò)程的不同時(shí)間段對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生存率影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(不同時(shí)間點(diǎn)F值分別為2.961、0.521、0.560、0.604/0.590，P值分別為

8、0.127、0.642、0.697、0.675、0.681)上述結(jié)果表明:RAW264.7細(xì)胞體外增殖活性不受PEMF干預(yù)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行也在此基礎(chǔ)之上。
　　1.2 PEMF導(dǎo)致破骨分化相關(guān)基因蛋白及標(biāo)志物的表達(dá)水平下降
　　我們觀察了破骨分化過(guò)程中2天和4天時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)RAW264.7細(xì)胞TRAP、MMP9、NFAT及CTSK基因及蛋白水平的影響，結(jié)果表明:與Control組比較，分化過(guò)程中2d和4d的WB和PCR顯

9、示，RANKL組各類(lèi)破骨分化基因及蛋白的表達(dá)均顯著升高，而RANKL+PEMF組可以降低上述各類(lèi)基因及蛋白的表達(dá)水平（F值及P值見(jiàn)表1-4、1-5）;各類(lèi)蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)之間的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，隨時(shí)破骨細(xì)胞分化過(guò)程的進(jìn)行，其相應(yīng)基因及蛋白的表達(dá)均有增加，但并非均有顯著差異。TRAP染色檢測(cè)結(jié)果顯示:與RANKL組相比較，RANKL+PEMF組TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，多核巨細(xì)胞數(shù)量少，TRAP活性低。（F=83.69，P＜0.000

10、1）骨片吸收陷窩面積測(cè)定結(jié)果顯示:RANKL+PEMF組骨片吸收面積較RANKL組顯著降低。(F=55.06，P＜0.0001)
　　2.PEMF抑制RAW264.7細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化
　　在施加RANKL刺激24小時(shí)后的RAW264.7細(xì)胞，本文測(cè)定了不同實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化的影響，結(jié)果顯示:與Control組比較，RANKL組能引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子發(fā)生變化，產(chǎn)生鈣振蕩，PEMF組(0.322±0.012)可使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鈣

11、振蕩的細(xì)胞數(shù)比例顯著下降(F=40.62，P＜0.0001)然而RANKL+Nife（0.293±0.009）與RANKL+SKF-96365組(0.221±0.006)處理同樣可以產(chǎn)生PEMF的效果，使細(xì)胞鈣振蕩出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且三者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，上述結(jié)果說(shuō)明:PEMF對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化均有調(diào)控作用，但具體作用位點(diǎn)仍期待進(jìn)一步探索。
　　3.PEMF抑制Ca2+-Calcineurin-NFATc1破骨分化信號(hào)通路
　

12、　在培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞上，我們觀測(cè)了PEMF對(duì)Ca2+-Calcineurin-NFATc1破骨分化信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示:Calcineurin蛋白表達(dá)水平在不同處理組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.893，P=0.217)，但Calcineurin的活性檢測(cè)結(jié)果表明，與Control組相比，RANKL組顯著增高Calcineurin的活性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=9.075，P=0.026)，但Calcineurin的蛋白水平僅具有

13、上升的趨勢(shì)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接著我們測(cè)定了NFATc1的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位情況，結(jié)果顯示:RANKL組的胞質(zhì)c-NFATc1蛋白降低(F=27.38，P＜0.001)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而核蛋白n-NFATc1顯著增加（F=11.92，P=0.003）。PEMF組細(xì)胞的Calcineurin的活性及NFATc1蛋白轉(zhuǎn)位無(wú)顯著影響，但PEMF對(duì)RANKL誘導(dǎo)的Calcineurin的活性升高均有顯著的抑制作用。結(jié)果顯示:與RANKL組比較，RAN

14、KL+PEMF組的Caleineurin的活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。核蛋白n-NFATc1減少，胞質(zhì)蛋白c-NFATc1顯著升高。此外，在特異性信號(hào)通路阻滯劑作用下，結(jié)果表明:RANKL+Nife組與RANKL+FK506組較RANKL組，Calcineurin的活性及破骨分化蛋白表達(dá)水平均顯著降低（FCTSK=3.184，P=0.031;FNFATC1=9.682，P＜0.001），表明Ca+-Calcineurin-NFATc1

15、信號(hào)通路確實(shí)參與破骨分化，而二者加上PEMF刺激后，上述蛋白表達(dá)進(jìn)一步出現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明PEMF通過(guò)調(diào)控Ca2+-Calcineurin-NFATc1信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化。
　　結(jié)論：
　　1.體外環(huán)境下，PEMF可抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，并抑制其骨吸收作用。
　　2.PEMF可降低RAKKL活化的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)表達(dá)。
　　3.PEMF抑制Calcineuri