利塞膦酸鈉抑制骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化并通過逆轉(zhuǎn)RANKL-OPG的表達抑制破骨細胞分化.pdf

1、背景:
　　 骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞為特點，并導致骨脆性增加及易引起骨折的一類疾病。骨質(zhì)疏松癥波及全球約200，000，000人口，給家庭及社會帶來了嚴重的經(jīng)濟負擔。國際骨質(zhì)疏松基金會(IOF)的資料顯示，34％的絕經(jīng)后婦女及20％的老年男性罹患此病。骨質(zhì)疏松癥所致的骨折及其嚴重并發(fā)癥導致死亡率正逐年上升。
　　 骨質(zhì)疏松癥及老年性骨量減少，在骨量減少的同時通常伴隨著骨髓內(nèi)脂肪組織的增多。實際上，骨髓內(nèi)脂肪

2、的異常增多在所有骨丟失性疾病上均有體現(xiàn)，如去勢后骨質(zhì)疏松、廢用性骨質(zhì)疏松及糖皮質(zhì)激素引發(fā)的骨質(zhì)疏松。如今，脂肪組織的功能已不再被認為是單純的能量儲存及空間填充作用，它可以作為內(nèi)分泌器官，分泌各種細胞因子及激素，參與骨代謝活動。骨髓內(nèi)的脂肪細胞有望成為骨質(zhì)疏松癥診斷、預防及治療的新靶點。
　　 骨組織的穩(wěn)態(tài)主要取決于骨吸收及骨形成的相互平衡。起骨吸收作用的主要細胞是破骨細胞。破骨細胞主要來源于單核巨噬細胞系統(tǒng)，由單核細胞融合分化而

3、成。其分化和成熟依賴于巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、護骨素(OPG)及護骨素配體（RANKL）。OPG及RANKL主要來源于成骨細胞、基質(zhì)細胞，對骨重建起著重要的作用。RANKL通過與表達于破骨細胞的細胞核因子-κB受體活化因子（RANK）結(jié)合，能夠刺激破骨細胞活化和增殖;OPG與RANK競爭結(jié)合RANKL，從而抑制骨吸收，防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生。RANKL/RANK/OPG軸的失衡是導致很多溶骨性骨異常吸收疾病的主要原因。
　

4、　 利塞膦酸鈉（RIS），是第三代雙膦酸鹽的代表，系含氮雙膦酸鹽，具有顯著的抗骨吸收作用，臨床療效好，安全性高，被廣泛應用于抗骨質(zhì)疏松的治療。既往對抗骨質(zhì)疏松藥物的研究往往局限于破骨細胞和成骨細胞本身，其對骨髓內(nèi)含量最豐富的脂肪組織的影響及機制的研究尚未明確。
　　 目的:
　　 本文通過細胞試驗，探討了利塞膦酸鈉對人骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化過程中產(chǎn)生的RANKL/OPG的變化，及對破骨細胞的影響，為闡明利塞膦酸鈉防治

5、骨質(zhì)疏松癥的機制提供新的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 本研究旨在通過分子、細胞探討利塞膦酸鈉抑制脂肪細胞分化，并通過OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)調(diào)節(jié)破骨細胞的生成。用RT-PCR，ELISA和Western blotting等生物學技術，從基因及蛋白表達水平，研究利塞膦酸鈉對人骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化的影響，及其表達的RANKL/OPG的情況，研究其相應的分子生物學基礎，并對其相關的分子作用機制進行初步探討。

6、>　　 結(jié)果:
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細胞具有體外成脂、成骨雙向誘導分化能力
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞作為多能干細胞的成脂、成骨雙向分化能力的證實。骨髓間充質(zhì)干細胞成脂誘導2周后，胞漿內(nèi)大量脂滴形成。PPARγ特異性表達。骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導3周后，經(jīng)茜素紅染色可見細胞表面及胞漿內(nèi)大量鈣結(jié)節(jié)形成。
　　 2、利塞膦酸鈉濃度依賴性抑制骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化
　　 利塞膦酸鈉呈濃度依賴性抑制人骨髓

7、間充質(zhì)干細胞成脂分化。不同濃度的利塞膦酸鈉（1～25μmol/L）作用于成脂誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞，成脂率(ADpencent)呈濃度依賴性下降(P＜0.05)。
　　 3、人骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化時RANKL/OPG表達上調(diào)
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞成脂誘導分化2周。Westen Blot結(jié)果顯示:RANKL蛋白表達顯著升高，OPG蛋白表達無顯著變化，RANKL/OPG顯著升高(P＜0.05)。
　　 4、利塞

8、膦酸鈉逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化過程中RANKL/OPG的表達
　　 利塞膦酸鈉在人骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化過程中呈濃度依賴性抑制RANKL水平的表達。Westen Blot結(jié)果顯示:與對照組相比，不同濃度的利塞膦酸鈉（1～25μmol/L）分別作用于成脂誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞，利塞膦酸鈉呈劑量依賴性抑制骨髓間充質(zhì)干細胞成脂過程中RANKL/OPG的表達(P＜0.05)。
　　 5、利塞膦酸鈉對未成脂誘導的骨髓間充質(zhì)干

9、細胞表達的RANKL/OPG蛋白表達無影響
　　 未成脂誘導的人骨髓間充質(zhì)干細胞以利塞膦酸鈉進行干預。Westen Blot結(jié)果顯示:利塞膦酸鈉不能影響骨髓間充質(zhì)干細胞RANKL/OPG表達。
　　 6、利塞膦酸鈉抑制脂肪細胞來源的炎癥因子分泌
　　 ELISA結(jié)果顯示:濃度為10μmol/L的利塞膦酸鈉干預成脂誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞36h后，與對照組相比，IL-1、TNF-α表達顯著降低(P＜0.05)，IL-

10、6的表達也有下降，但與對照組比較無統(tǒng)計學意義。
　　 7、利塞膦酸鈉抑制骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化時m TORC1信號通路被抑制。
　　 Westen Blot結(jié)果顯示:與對照組相比，成脂誘導、利塞膦酸鹽干預24h的骨髓間充質(zhì)干細胞的PS6表達受到顯著抑制。
　　 結(jié)論:
　　 通過細胞實驗證明，利塞膦酸鈉可以通過下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞來源的脂肪細胞RANKL/OPG及炎癥因子的表達，進而抑制破骨細胞的分化，