虎杖苷通過(guò)調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)和Calcineurin-NFAT3信號(hào)通路抑制心肌肥大.pdf

1、目的:
　　本文以苯氧腎上腺素所誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大和壓力負(fù)荷所誘導(dǎo)的成年小鼠肥大為出發(fā)點(diǎn)，首先探討虎杖苷能否介導(dǎo)抑制苯氧腎上腺素心肌肥大和主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的心肌重構(gòu);其次，研究虎杖苷對(duì)鈣信號(hào)和心肌收縮的影響;最后，從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度討論虎杖苷是否通過(guò)作用于Calcineurin/NFAT信號(hào)通路抑制心肌肥大。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)方法
　　1.1 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)
　　離體實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)立對(duì)照組(Con)

2、，虎杖苷單獨(dú)作用組(PD)，苯氧腎上腺素組(PE)，苯氧腎上腺組+虎杖苷(PE+PD)，白藜蘆醇單獨(dú)作用組(RV)，苯氧腎上腺組+白藜蘆醇(PE+RV)，苯氧腎上腺組+硝苯地平(PE+Nife)，苯氧腎上腺組+虎杖苷+硝苯地平(PE+PD+Nife)，苯氧腎上腺素組+他克司莫(PE+FK506)，苯氧腎上腺組+虎杖苷+他克司莫(PE+PD+FK506)，檢測(cè)不同的基因蛋白表達(dá)。在體實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)立假手術(shù)組(Sham)，主動(dòng)脈縮窄手術(shù)(TA

3、C)，虎杖苷單獨(dú)作用組(PD)，主動(dòng)脈縮窄+虎杖苷(TAC+PD)。
　　1.2 心肌肥大基因的表達(dá)以及心臟功能的測(cè)定
　　離體部分，分離乳鼠心肌細(xì)胞，饑餓24h，PE（20μmol/L），PD(乙醇溶解，50μmol/l)刺激72h。Western blot檢測(cè)各組ANP和β-MHC的表達(dá)，以及心肌細(xì)胞面積。在體部分，采用小動(dòng)物超聲對(duì)小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的心臟結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行評(píng)估，其中PD組（β-環(huán)糊精溶解，PD用量50mg/kg

4、/day），術(shù)后一周開(kāi)始灌胃，直到13周結(jié)束，TAC+PD（β-環(huán)糊精溶解），術(shù)后一周開(kāi)始灌胃直到13周結(jié)束。
　　結(jié)果:
　　第一部分:虎杖苷抗心肌肥厚作用
　?。ㄒ唬╇x體實(shí)驗(yàn)PD抗心肌肥厚作用
　　1、 PD減少ANP和β-MHC蛋白表達(dá)
　　我們首先觀察了，不同處理組對(duì)細(xì)胞ANP和β-MHC蛋白水平的影響，結(jié)果顯示，各組之間的ANP和β-MHC蛋白水平均有顯著性差異（F值分別為6.259、13.728

5、;P值分別為0.017、0.002）。與Control組相比，PE組心肌細(xì)胞ANP(ANP/β-actin:1.00±0.00 vs.1.96±0.42,P=0.017)和β-MHC(β-MHC/β-actin:1.00±0.00 vs.2.22±0.35，P=0.002)的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而PE+PD組可以部分抑制上述兩種基因的表達(dá)水平(P＜0.05-0.001)。細(xì)胞面積測(cè)定結(jié)果顯示:與PE（1914.62±530.47）組相比，

6、PE+PD組心肌細(xì)胞面積（1475.80±483.27）顯著降低。
　　2、PD和RV抗心肌肥厚作用比較
　　不同處理組對(duì)細(xì)胞β-MHC的mRNA水平，ANP和β-MHC蛋白水平的影響，結(jié)果顯示，各組之間的β-MHC的RNA水平ANP和β-MHC蛋白水平均有顯著性差異（F值分別為6.206、4.126、9.319;P值分別為0.005、0.021、0.001）。
　?。ǘ┰隗w實(shí)驗(yàn)PD抗心肌肥厚作用
　　1、PD

7、抑制心肌重構(gòu)
　　我們觀察了5w、13w小鼠的LVPWs和LVPWd，結(jié)果顯示，在5w、13w時(shí)，各組間的LVPWs數(shù)值具有顯著差異（F值分別為20.797、15.915;P值分別為0.000、0.000）。各組間的LVPWd數(shù)值具有顯著差異（F值分別為11.234、11.359;P值分別為0.000、0.001）。與同時(shí)期的Sham組相比較，TAC組的LVPWs和LVPWd顯著增加，而PD處理能夠顯著的抑制增高的后壁厚度。

8、>　　同樣的，與Sham組比較，在5w時(shí)，TAC組的LVIDs和LVIDd顯著減小，13w時(shí)顯著增大，而PD處理后，與TAC比較，TAC+PD組，5w時(shí)能顯著的抑制心腔的縮小，13時(shí)能顯著的抑制心腔的擴(kuò)大。
　　2、PD改善心功能
　　我們觀察了不同時(shí)間點(diǎn)各組的LVFS和EF。結(jié)果顯示，5w、13w時(shí)，LVFS各組間有顯著性差異（F值分別為7.948、12.597;P值分別為0.000、0.000）。EF各組間有顯著性差異（

9、F值分別為6.180、11.228;P值分別為0.008、0.001）。與Sham(30.69±3.93)相比，TAC組5w時(shí)，LVFS增高為44.11±6.09，P＜0.01，與Sham組(52.94±4.23)比較，EF增高為71.99±5.78，P＜0.01，有顯著差異。在13w時(shí)，二者顯著低于Sham，其中，LVFS降低為21.36±4.48(vs sham32.94±1.69)，P＜0.01，有顯著差異。EF降低到38.00±

10、7.12（vs sham，54.25±2.48），P＜0.01，有顯著差異。PD處理后，與Sham比較，5w時(shí)，TAC+PD組，LVFS和EF平穩(wěn)的增加，P＞0.01，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而13w時(shí)，PD處理后，TAC+PD組遠(yuǎn)沒(méi)到失代償階段，與TAC比較，TAC+PD組的LVFS增高到34.45±4.11，P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而EF增高到56.93±5.27，P＜0.01，差異顯著。而PD單獨(dú)處理組，與Sham比較，無(wú)顯著差異。<

11、br>　　3、PD抑制心肌肥厚小鼠HW/BW
　　我們?cè)?3w，觀察了不同處理組對(duì)小鼠的HW/BW的影響，結(jié)果顯示不同處理組間具有顯著性差異（F值為0.000;P值為21.143）。相比于Sham（0.504％±0.01％）組，TAC組的HW/BW也是顯著增高到0.627％±0.04％，P＜0.01而PD治療后，與TAC組比較，TAC+PD組心重體重比下降到0.549％±0.03％，P＜0.01，但TAC+PD組與Sham組比較，

12、升高了8.9％，P值小于0.01。
　　第二部分:虎杖苷對(duì)心肌鈣信號(hào)的作用
　　1、PD對(duì)乳鼠心肌鈣信號(hào)的影響
　　在培養(yǎng)的NRVMs上，我們檢測(cè)了各種處理對(duì)鈣信號(hào)的影響，包括△F/F0，rise time，T50，結(jié)果顯示，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中△F/F0，rise time，T50分別為13.18、6.898、12.453;P值分別為0.000、0.000、0.000）。與Con(4.52±1.18)比較，PE

13、刺激能使△F/F0增高到6.32±2.12（vs con，4.52±1.18），P＜0.01，SR回收Ca2+的時(shí)間（鈣瞬變半衰期，T50）、顯著延長(zhǎng)為170.13±48.42(vs con，137.63±20.52)，P＜0.01。此外持續(xù)性的PE刺激，導(dǎo)致鈣瞬變的上升時(shí)間(risetime)顯著增加到74.29±27.9（vs con，53.13±18.49），P＜0.01，PD單獨(dú)處理組使正常細(xì)胞鈣瞬變有下降的趨勢(shì)，P＞0.05，

14、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，與PE組相比，PE+PD（4.86±1.47）組能顯著降低PE所誘導(dǎo)增加的鈣瞬變(vs PE，P＜0.01)，與PE組相比，PE+PD組的rise time和T50的分別降低為143.54±17.83，P＜0.05，和57.34±18.07，P＜0.05，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、PD對(duì)成年小鼠心肌鈣信號(hào)的影響
　　在5w時(shí)，我們分離個(gè)成年小鼠單個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)PD對(duì)鈣信號(hào)的影響，包括△F/F0，Sho

15、rtening，T50，方差分析結(jié)果表明，各組間分別具有差異（F值分別為6.017、10.817、10.985;P值分別為0.000、0.000、0.000）。與Sham組(1.80±0.60)比較，TAC組鈣瞬變(△F/F0)增加到2.47±0.96，P＜0.01，而T50延長(zhǎng)為196.33±35.18(vs sham，172.00±15.19)，P＜0.01，與TAC相比，TAC+PD組能顯著降低到1.83±0.83，P＜0.01，

16、并且T50降低到165.00±34.89，P＜0.01。與Sham組(4.69±1.53)比較，TAC組在5w時(shí)，心肌收縮力增加到6.56±3.13，P＜0.01，與Sham比較，TAC+PD組分離出的單個(gè)心肌細(xì)胞的鈣瞬變無(wú)顯著變化，P＞0.05，但收縮力卻顯著增高到6.49±2.69（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.PD可增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗肥厚能力。
　　2.PD具有抗抑制心臟重構(gòu)、改善心功能的作用，延緩從心肌肥