Wnt5a-Ca2+-Calcineurin-NFAT通路對黑素瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響.pdf

1、黑素瘤的增殖與侵襲是其惡性生物學(xué)行為的主要特征,也是黑素瘤難治愈,預(yù)后差、易復(fù)發(fā)的主要因素。對黑素瘤侵襲與轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研究,特別是分子阻斷和基因治療的研究是治愈黑素瘤的希望所在。信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)通過很復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)傳導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用,是基因與外界聯(lián)系的通道。惡性黑素瘤的發(fā)生發(fā)展伴隨著多種信號(hào)通路的異常,其中 Wnt信號(hào)通路在黑素瘤的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用成為當(dāng)前黑素瘤研究的熱點(diǎn)。Wnt信號(hào)通路重要配體 Wnt5a參與調(diào)控黑素瘤的侵襲與轉(zhuǎn)

2、移。胞內(nèi)受體鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)是唯一受Ca2+和鈣調(diào)素(calmodulin CaM)調(diào)控的保守的Ser/Thr蛋白磷酸酶,可使活化T細(xì)胞核因子(Nuclear factor of activated T cells,NFAT)去磷酸化,促使NFAT轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核,作用于下游靶分子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、原癌基因 c-myc、環(huán)氧合酶2(COX-2),調(diào)控黑素瘤的生物學(xué)行為。Calcineurin//N

3、FAT信號(hào)通路異常與黑素瘤的增殖、侵襲密切相關(guān)。探明Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號(hào)通路在黑素瘤生物學(xué)性能中的作用對分子靶向治療黑素瘤將具有重要的科研與臨床意義。本課題組首先利用RT-PCR及Western blot檢測了惡性黑素瘤中 Wnt/Ca2+信號(hào)通路中重要信號(hào)分子的表達(dá)情況,用免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi) Ca2+變化,證實(shí)在黑素瘤中 Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路處于激活狀態(tài)。探討

4、Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路在黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)中的作用是本課題重點(diǎn)研究的內(nèi)容,我們利用新型慢病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建wnt5a的過表達(dá)載體和siRNA表達(dá)載體,檢測該通路中重要信號(hào)分子的表達(dá)變化及慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力變化。證實(shí)Wnt5a/Ca2+/ Calcineurin/NFAT通路可能在黑素瘤細(xì)胞增殖、侵襲中發(fā)揮重要作用,為黑素瘤的分子靶向治療提供新靶點(diǎn)和新方向。
　　實(shí)驗(yàn)一過表達(dá)和抑表達(dá)

5、wnt5a穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞株的建立
　　根據(jù)人wnt5a基因mRNA序列設(shè)計(jì)針對Wnt5a CDS序列的PCR引物和wnt5a siRNA。選擇黑素瘤細(xì)胞株WM793B(wnt5a+++)提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR,獲得wnt5a cDNA,克隆入穿梭質(zhì)粒載體pENTR3C中,獲得重組質(zhì)粒pENTR3C-wnt5a。將重組質(zhì)粒pENTR3C-wnt5a與骨架質(zhì)粒pLenti6.3/V5-DEST進(jìn)行同源重組反應(yīng),獲得重組質(zhì)粒

6、pLenti6.3-wnt5a。利用慢病毒包裝系統(tǒng)和HEK293T細(xì)胞包裝出含有pLenti6.3-wnt5a的慢病毒顆粒,感染黑素瘤細(xì)胞A2058(wnt5a-),建立穩(wěn)定過表達(dá)wnt5a穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058-pLenti6.3-Wnt5a。構(gòu)建下調(diào)wnt5a基因的重組質(zhì)粒pLKO.1-shwnt5a,利用慢病毒包裝系統(tǒng)和HEK293T細(xì)胞包裝、制備攜帶shwnt5a的重組慢病毒顆粒,感染W(wǎng)M793B黑素瘤細(xì)胞(wnt5a+++

7、),建立穩(wěn)定低表達(dá)wnt5a穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞系WM793B-pLKO.1-shwnt5a。對經(jīng)過篩選、單克隆培養(yǎng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞中Wnt5a蛋白表達(dá)情況進(jìn)行Western-Blot檢測:A2058-pLenti6.3-Wnt5a細(xì)胞中Wnt5a高效過表達(dá);WM793B-pLKO.1-shwnt5a細(xì)胞中Wnt5a被有效的抑制。證實(shí)獲得了穩(wěn)定過表達(dá)和抑表達(dá)Wnt5a的穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞系,為研究Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NF

8、AT通路對黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)的影響提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　實(shí)驗(yàn)二調(diào)控Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路對黑素瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響
　　采用Western blot技術(shù)檢測過表達(dá)和低表達(dá)Wnt5a的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路中重要的信號(hào)分子VEGF、CAN、NFAT的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路中信號(hào)分子VE

9、GF、CAN、NFAT的表達(dá)在Wnt5a表達(dá)升高會(huì)出現(xiàn)不同程度的升高,在Wnt5a表達(dá)被抑制時(shí)出現(xiàn)不同程度的降低。
　　對建立的過表達(dá)和抑表達(dá)wnt5a的穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)性能檢測:利用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力;利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析對比示:過表達(dá)wnt5a組較空白對照組增殖、侵襲能力增強(qiáng);抑表達(dá)wnt5a組較空白對照組增殖、侵襲能力減弱,同時(shí)用相同的方法檢

10、測環(huán)孢素A處理過的過表達(dá)wnt5a穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞的侵襲、增殖能力和細(xì)胞周期的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明環(huán)孢素A處理后的黑素瘤細(xì)胞的S期降低,增殖、侵襲能力減弱。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立過表達(dá)和抑表達(dá) wnt5a慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)黑素瘤細(xì)胞系,為進(jìn)一步研究Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路在黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)中的作用提供了模型和平臺(tái)。
　　2.過表達(dá)Wnt5a可致黑素瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力升高;抑制Wnt5a