DNMT1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖侵襲能力的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含量最多的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，它在多種腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，其發(fā)生往往先于甲基化狀態(tài)的異常，因而是腫瘤細(xì)胞所具有的特征性的早期分子改變。DNMT1主要介導(dǎo)甲基化模式的建立與維護(hù)。高表達(dá)的DNMT1可以引起甲基化模式發(fā)生異常，抑癌基因沉默、原癌基因激活，并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，由于缺乏有效的早期診斷與治療的標(biāo)記分子，多數(shù)患

2、者就診時(shí)已屬于進(jìn)展期，預(yù)后較差。本研究將通過檢測(cè)胃癌組織中DNMT1表達(dá)水平、觀察DNMT1變化對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲能力及相關(guān)分子表達(dá)的影響，探討DNMT1與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及部分機(jī)制，為進(jìn)一步豐富胃癌的診治思路提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)60對(duì)胃癌組織及癌旁正常組織中DNMT1的表達(dá)水平。
　　2.構(gòu)建DNMT1-shRNA慢病毒載體和載體質(zhì)粒，測(cè)定慢病毒的包裝和病毒滴

3、度，評(píng)價(jià)干擾載體對(duì)靶基因的干擾效果。轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN45、SGC7901、MKN28，構(gòu)建DNMT1-shRNA穩(wěn)定株，并建立慢病毒陰性對(duì)照（NC-shRNA）轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞株作為對(duì)照組。
　　3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定分析轉(zhuǎn)染了DNMT1-shRNA對(duì)MKN45、SGC7901、MKN28細(xì)胞株及對(duì)照組的增殖能力影響。
　　4.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染了DNMT1-shRNA對(duì)MKN45、SGC7901、MK

4、N28細(xì)胞株與對(duì)照細(xì)胞株的遷移能力。
　　5.使用Western-blotting和Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了DNMT1-shRNA對(duì)MKN45、SGC7901、MKN28細(xì)胞株及對(duì)照組中的CDC25B表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常胃粘膜組織相比，胃癌組織中的DNMT1的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。60例胃癌組織中52例（86.7%，52/60）DNM

5、T1的表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織，其中17例（28.3%，17/60）表達(dá)上調(diào)2倍以上；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有癌旁脈管浸潤及TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的胃癌患者，其DNMT1表達(dá)水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無癌旁脈管浸潤及TNM分期I-II期患者（P＜0.05）。
　　2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染了DNMT1-shRNA的胃癌細(xì)胞株較對(duì)照組的增殖能力明顯降低（P＜0.05）,提示DNMT1可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。
　　3.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：干擾

6、DNMT1可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力（P＜0.05）。
　　4.Real-time PCR及免疫印跡法顯示：干擾DNMT1可以明顯使胃癌細(xì)胞MKN45、SGC7901及MKN28中CDC25B的蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示干擾DNMT1后可以使胃癌細(xì)胞中CDC25B的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，提示CDC25B可能是DNMT1的下游靶基因，DNMT1可能通過調(diào)控CDC25B表達(dá)影響胃癌的發(fā)生與進(jìn)展。