OPG調(diào)控破骨細胞NF-κB通路的研究.pdf

1、機體維持骨組織不斷更新，保持生命活力是依靠骨代謝完成的。骨代謝平衡一旦被打破，機體便會出現(xiàn)各類代謝性骨病，其中骨營養(yǎng)不良性疾病如骨質(zhì)疏松主要是由破骨細胞(osteoclasts，OC)產(chǎn)生的骨吸收大于成骨細胞(osteoblasts，OB)產(chǎn)生的骨再建所引起的。研究發(fā)現(xiàn)，當機體受到骨吸收刺激時，成骨細胞/基質(zhì)細胞膜上表達的細胞核因子-κB受體活化因子配基(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand

2、，RANKL)，通過與破骨細胞前體細胞膜上細胞核因子-κB受體活化因子(receptoractivatorofnuclearfactor-κB，RANK)結合，促進OC的分化和成熟。核因子-κB(NF-κB)信號通路是參與調(diào)控OPG抑制OC分化成熟的信號轉(zhuǎn)導通路之一，吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)作為NF-κB特異性抑制劑被廣泛應用。本研究采用OPG/RANK/RANKL調(diào)控途徑在體外誘導破骨細胞前體細胞RAW264.7細胞株生成OC，

3、在此基礎上研究OPG抑制動物OC分化成熟的NF-κB信號轉(zhuǎn)導機制，為從分子水平揭示動物骨營養(yǎng)不良性疾病的發(fā)生及防治提供理論依據(jù)。
　　 1.RAW264.7細胞培養(yǎng)及RANKL、OPG、PDTC對細胞增殖的影響
　　 RAW264.7細胞在DMEM培養(yǎng)基中，于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。MTT法檢測其生長曲線，發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，細胞增殖速度逐漸增加，第3d進入對數(shù)增長期，第5d進入穩(wěn)定期。通過MTT法，檢測不同濃度R

4、ANKL(0、10、30、50、70ng/mL)、OPG(0、10、20、40、50ng/mL)和PDTC(0、10、50、100、150μM)對該細胞增殖的影響。結果表明:不同濃度RANKL均抑制細胞的增殖，隨濃度增加抑制作用增強，選取30ng/mL為實驗濃度;OPG在0～50ng/mL濃度范圍內(nèi)，對細胞增殖無明顯作用，選取0、20、50ng/mL為實驗濃度;不同濃度的PDTC均抑制細胞的增殖，隨濃度增加抑制作用增強，選取100μM為

5、作用濃度。
　　 2.RANKL體外誘導RAW264.7細胞株分化為OC及OPG的影響
　　 RAW264.7細胞以5×103cells/mL密度接種于96孔板，加入α-MEM培養(yǎng)基，于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，至第6d。5％多聚甲醛固定，以抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒染色，其中含有三個或三個以上細胞核的TRAP陽性多核細胞即為OC。在此基礎上，分組:A組為空白組，B組添加20ng/mLOPG，C組

6、添加30ng/mLRANKL，D組添加30ng/mLRANKL+20ng/mLOPG，E組添加30ng/mLRANKL+50ng/mLOPG。誘導至第6d，5％多聚甲醛固定，TRAP試劑盒染色，生成的OC計數(shù)，結果表明:A、B組只有極少量的OC生成;C組生成TRAP陽性多核細胞數(shù)量極顯著高于其他組(P＜0.01);D組生成TRAP陽性多核細胞數(shù)量極顯著低于C組(P＜0.01)，極顯著高于A、B、E組(P＜0.01);E組生成TRAP陽性

7、多核細胞數(shù)量極顯著低于C、D組(P＜0.01)。由此可見，C、D、E組在添加相同RANKL的基礎上，隨著添加OPG濃度的增加，OC數(shù)量逐漸減少，至50ng/mLOPG時，只有極少量的OC生成。
　　 3.OPG對OC形成過程中NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路關鍵信號分子表達的影響
　　 在誘導RAW264.7細胞分化生成OC的過程中進行如下處理，A組為對照組，B組添加20ng/mLOPG，C組添加30ng/mLRANKL，D組添加

8、30ng/mLRANKL+20ng/mLOPG，E組添加30ng/mLRANKL+50ng/mLOPG。提取細胞核蛋白、漿蛋白和細胞全蛋白，通過蛋白印跡(WesternBolt)技術檢測NF-κBp65及IκB的表達。結果表明，實驗組NF-κBp65表達量隨添加OPG濃度的增加而降低，細胞IκBα、IκBβ表達量逐漸增加。
　　 添加100μMPDTC阻斷NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路后，檢測上述關鍵信號分子的表達。在誘導RAW264.

9、7細胞分化生成OC的過程中進行如下處理，A組添加100μMPDTC，B組添加20ng/mLOPG+100μMPDTC，C組添加30ng/mLRANKL+100μMPDTC，D組添加30ng/mLRANKL+20ng/mLOPG+100μMPDTC，E組添加30ng/mLRANKL+50ng/mLOPG+100μMPDTC。處理結束后提取細胞核蛋白、漿蛋白以及細胞全蛋白，通過蛋白印跡(WesternBolt)技術檢測NF-κBp65及Iκ