破骨細(xì)胞形成抑制因子（OPG）的表達(dá)純化及功能研究.pdf

1、破骨細(xì)胞形成抑制因子(OPG)對(duì)骨的重建與再吸收有重要調(diào)節(jié)作用，其TNF結(jié)構(gòu)區(qū)行使抑制破骨細(xì)胞形成與活性的功能。通過PCR將該區(qū)基因片段擴(kuò)增出來，命名為OPG-T。為了探討利用大腸桿菌大規(guī)模生產(chǎn)重組OPG蛋白的可能性，將OPG、OPG-T及突變體基因OPG-372插入表達(dá)載體PET-28a質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中分別進(jìn)行表達(dá)研究。　　將破骨細(xì)胞形成抑制因子OPG及變體OPG-372基因克隆于昆蟲病毒轉(zhuǎn)移載體pBa

2、cPAK8中，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8-OPG、pBacPAK8-OPG-372，將它們與線性化的Bm-BacPAK6病毒DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，經(jīng)體內(nèi)重組，挑斑篩選，獲得Bm-OPG和Bm-OPG-372重組病毒。經(jīng)SouthernBlot分析，表明兩種重組病毒基因組中分別含OPG和OPG-372基因。將Bm-OPG和Bm-OPG-372重組病毒分別在家蠶細(xì)胞和幼蟲表達(dá)，SDS-PAGE和Westernblot分析結(jié)果表明OPG

3、、OPG-372基因被表達(dá)?！　±肧eizePrimaryMammalianImmunoprecipitationKit純化到高純度的重組蛋白，并進(jìn)行了ELISA定量和質(zhì)譜分析。經(jīng)SDS-PAGE分析，rh-OPG-372蛋白在膠上有一條帶，分子量約為46kDa；而rh-OPG能看到兩條蛋白帶，分別約為55kDa和110kDa，經(jīng)還原反應(yīng)后，則在電泳過程中呈現(xiàn)為一條55kDa帶，表明110kDa的蛋白可能是二聚體。用純化后的rh-O