補腎中藥血清對破骨細胞的生物學(xué)作用及OPG-OPGL與破骨細胞活性的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：1.探討補腎中藥(骨靈丸)血清的最優(yōu)提取方法；2.觀察補腎中藥血清對體外培養(yǎng)破骨細胞骨吸收功能的影響；3.探討補腎中藥血清對破骨細胞RANK基因表達水平的影響；4.探討補腎中藥對成骨-破骨細胞共育體系中護骨素/護骨素配體的蛋白及基因表達水平的影響及與破骨細胞活性的相關(guān)性。 方法：1.按處方配制補腎中藥，傳統(tǒng)方法熬煮中藥，水浴鍋濃縮至252ml，SD大鼠36只隨機分成空白組(生理鹽水2ml)、低劑量組(生藥1.77g/次)、

2、中劑量組(生藥3.54g/次)、高劑量組(生藥7.08g/次)，每日早晚2次灌胃，共3天，第4日末次灌胃后1小時采血，離心，吸取血清，大部分血清56℃，30分鐘滅活保存，部分用于干預(yù)成骨細胞試驗；取SD胎鼠的頭蓋骨分離培養(yǎng)獲得純化的成骨細胞，使用MTT比色分析方法在酶標儀上測試滅活前后血清干預(yù)的成骨細胞增殖情況，記錄每組A570值；對硝基苯磷酸鹽法(PNPP)測各組堿性磷酸酶活性，使用SPSS10.0軟件包的配對T檢驗比較滅活前后血清對

3、成骨細胞生物學(xué)作用的差別; 2.取SD大鼠的胎鼠四肢骨分離培養(yǎng)破骨細胞(OC)，差異貼壁法獲得純度在95％以上的破骨細胞，分成低、中、高、空白對照四組，每組6孔，施加相應(yīng)濃度的補腎中藥血清，對照組采用無中藥血清，培養(yǎng)24小時，酶動力學(xué)法測定培養(yǎng)上清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性，甲苯胺藍染色骨吸收陷窩并在圖像分析儀下測定骨吸收陷窩的面積和數(shù)目，使用SPSS10.0軟件包的單因素方差分析比較補腎中藥血清對破骨細胞生物學(xué)作用

4、的差別； 3.取SD大鼠的胎鼠四肢骨分離培養(yǎng)破骨細胞(OC)，差異貼壁法獲得純度在95％以上的破骨細胞，分成低、中、高、空白及陽性對照5組，每組6孔，施加相應(yīng)濃度的補腎中藥血清，空白組采用無中藥血清，陽性對照組使用17-β雌二醇，在培養(yǎng)的破骨細胞中施加不同濃度的補腎中藥血清培養(yǎng)24小時，收集破骨細胞使用TRIzol方法提取總RNA，使用DNAman軟件設(shè)計引物序列，RT-PCR方法擴增目標片段，使用Hema凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測條

5、帶OD值，比較各組目標帶與內(nèi)參的比值，使用SPSS10.0軟件包的單因素方差分析反應(yīng)破骨細胞中RANKmRNA表達水平的變化； 4.取SD大鼠的胎鼠顱骨與四肢骨分別分離、培養(yǎng)成骨細胞和破骨細胞，利用復(fù)合培養(yǎng)系統(tǒng)使二者生活在同一環(huán)境中，觀察細胞的形態(tài)變化；在復(fù)合培養(yǎng)體系中施加不同濃度的補腎中藥血清，并與空白組及雌激素組對照，培養(yǎng)24小時后收集成骨細胞，采用Westernblot方法及RT-PCR雜交法測定OB細胞中OPG/OPGL

6、蛋白的改變及基因表達的變化，使用SPSS10.0軟件包的單因素方差分析反應(yīng)成骨細胞中OPG/OPGL蛋白及mRNA表達水平的變化；酶動力學(xué)法測定培養(yǎng)上清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性，利用甲苯胺藍對骨吸收陷窩染色并在圖像分析儀下測定骨吸收陷窩的面積和數(shù)目，使用SPSS10.0軟件包的單因素方差分析比較補腎中藥血清對共培體系中破骨細胞生物學(xué)作用的差別，最后使用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件對OPG/OPGL的比值與破骨細胞的活性關(guān)系

7、進行相關(guān)分析。 結(jié)果：1.補腎中藥在末次灌胃后1小時達高峰，滅活前補腎中藥低、中、高濃度組及空白對照組A570(增殖率％)的值分別為(0.809±0.261)、(0.876±0.274)、(0.851±0.299)、(0.711±0.248)滅活后各組A570(增殖率％)的值分別為(0.669±0.179)、(0.751±0.211)、(0.725±0.209)、(0.454±0.154)，各組成骨細胞的增殖率、ALP的活性在滅

8、活前后的血清干預(yù)下有顯著性差異，P＜0.01，但滅活血清與對照組比較仍有明顯作用，P＜0.01； 2.單獨培養(yǎng)的破骨細胞在加入補腎中藥血清后培養(yǎng)上清中TRAP活力低、中、高與空白對照組分別是(1.36±0.14)U/L、(1.29±0.18)U/L、(1.31±0.24)U/L、(1.75±0.14)U/L(補腎中藥組與對照組相比P＜0.01，補腎中藥組間比較P＞0.05)；骨吸收陷窩的面積低、中、高與空白對照組分別是(293.

9、23±190.45)μm2、(335.40±202.33)μm2、(365.70±189.47)μm2、(495.25±210.37)μm2(補腎中藥組與對照組相比，P＜0.01，補腎中藥組間比較P＞0.05)，骨吸收陷窩數(shù)目分別是(11.40±1.50)個、(12.50±1.80)個、(14.40±2.42)個、(18.40±2.32)個(補腎中藥組與對照組相比，P＜0.01，補腎中藥組間比較P＞0.05)； 3.RT-PCR

10、顯示，補腎中藥血清能下調(diào)破骨細胞中RANKmRNA的表達，低濃度的補腎中藥血清即可降低RANKmRNA表達，但無明顯劑量相關(guān)性(補腎中藥組與對照組相比，P值均小于0.05，補腎中藥組間比較P＞0.05)，E2下調(diào)RANKmRNA的表達更為明顯(P＜0.01)； 4.復(fù)合培養(yǎng)體系中Westernblotting及RT-PCR顯示：補腎中藥血清能上調(diào)成骨細胞中OPG蛋白及OPGmRNA的表達，下調(diào)細胞中OPGL蛋白及OPGLmRNA

11、的表達，低濃度即有效(與對照組吸光度相比P＜005)，不同中藥濃度組無明顯差異(P＞0.05)；E2上調(diào)成骨細胞中OPG蛋白及OPGmRNA降低OPGL蛋白及OPGLmRNA的表達最為明顯(與對照組吸光度相比P＜0.01)；補腎中藥血清能降低復(fù)合培養(yǎng)體系破骨細胞的TRAP的活力，減少骨磨片陷窩吸收面積(補腎中藥組與對照組相比，P值均小于0.05)，但亦無明顯劑量相關(guān)性，不同中藥濃度組無明顯差異(P＞0.05)，E2下調(diào)TRAP活性及減少

12、骨磨片陷窩吸收面積更為明顯(P＜0.01)；統(tǒng)計學(xué)處理提示TRAP活力與骨磨片陷窩吸收面積服從正相關(guān)線性分布；骨磨片陷窩吸收面積和OPG/OPGL服從負相關(guān)線性分布。 結(jié)論：1.補腎中藥在末次灌胃后1小時采血此時的血清含藥物有效成分最高，滅活后血清能滿足試驗要求； 2.補腎中藥血清可抑制體外單獨培養(yǎng)的破骨細胞的骨吸收功能; 3.補腎中藥血清可抑制破骨細胞的RANK基因表達水平； 4.補腎中藥血清可抑制體外