破骨細胞形成的分子機制及溶骨性病變中破骨細胞的局部調(diào)控.pdf

1、第一部分破骨細胞形成的分子機制 目的:骨是一種不斷更新的組織，骨重建貫穿生命過程的始終。生理條件下，骨吸收與骨再生之間保持平衡狀態(tài)。如果這種平衡被打破就會發(fā)生骨硬化癥、骨質(zhì)疏松癥以及局灶性骨溶解等疾病。破骨細胞(osteoclast, OC)是肌體中最主要的骨吸收的效應(yīng)細胞；多種炎性及非炎性的骨與關(guān)節(jié)的病變都與OC代謝異常有關(guān)。對于OC形成及骨吸收活性調(diào)控的分子機制目前還存在廣泛的爭議。本實驗擬通過體外實驗，探討除RANKL誘導(dǎo)

2、的OC形成機制外，是否存在其它的OC形成的機制。 方法:將RAW264.7細胞系、小白鼠及人的外周血單個核細胞（PBMCs）在玻璃蓋玻片以及象牙磨片上作體外培養(yǎng)；在巨噬細胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）存在的條件下，分別加入不同劑量的核因子κB受體活化因子配體（Receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）、腫瘤壞死因

3、子α (Tumor necrosis factor α, TNFα)以及LIGHT (homologous to lymphotoxins, exhibits inducible expression, andcompetes with）共培養(yǎng)系統(tǒng)相比較，非接觸性共培養(yǎng)系統(tǒng)中多核細胞及骨吸收陷窩的數(shù)量均顯著減少。向假膜組織來源的FLSCs-PBMCs共培養(yǎng)系統(tǒng)中分別加入RANKL的拮抗劑OPG或者抗TNFα中和抗體，二者均顯著抑制但是未

4、能完全阻斷TRAP+多核細胞以及蟲噬樣骨吸收陷窩的形成；二者同時加入，則完全阻斷TRAP+多核細胞以及骨吸收陷窩的形成。向Paget’s病病灶以及Paget’s骨肉瘤病灶來源的FLSCs-PBMCs共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入OPG完全阻斷TRAP+多核細胞以及蟲噬樣骨吸收陷窩的形成；而向共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入抗TNFα中和抗體后，TRAP+多核細胞以及骨吸收陷窩的面積減少，但是差異不具有顯著性。 結(jié)果：⑴在M-CSF存在的條件下，向培養(yǎng)系統(tǒng)中

5、加入RANKL，無菌性松動的假體周圍假膜組織來源的巨噬細胞的體外培養(yǎng)體系中觀察到TRAP+、VNR+的多核細胞（MNCs），象牙磨片上觀察到蟲噬樣骨吸收陷窩的形成。⑵無菌性松動的假體周圍假膜組織、、Paget’s病以及Paget’s骨肉瘤病灶來源的FLSCs均表達RANKL和TNFα mRNA；并且在M-CSF存在的條件下，F(xiàn)LSCs與PBMCs 的接觸性與非接觸性共培養(yǎng)系統(tǒng)中均觀察到TRAP+、VNR+的多核細胞，象牙磨片上觀察到蟲噬

6、樣骨吸收陷窩的形成；與接觸性V glycoprotein D for HVEM, a receptor expressed by T lymphocytes)，并分別加入骨保護素(osteoprotegerin, OPG)、抗TNFα受體中和抗體以及抗HVEM中和抗體、抗L TβR中和抗體和LIGHT的餌受體DcR3。于培養(yǎng)結(jié)束后將部分細胞固定并進行抗酒石酸磷酸酶（Tartrate Resistent Acid Phosphatase,

7、 TRAP）、玻璃體結(jié)合蛋白受體（Vitronectin Receptor, VNR）以及絲狀肌動蛋白環(huán)（F-actin ring）染色；部分象牙磨片經(jīng)超聲處理去除表面細胞后分別進行表面噴涂金粉或者甲苯胺藍染色，電子顯微鏡或光學(xué)顯微鏡觀察象牙磨片表面蟲噬樣骨吸收陷窩的形成。 結(jié)論：無菌性松動假體周圍假膜組織中的巨噬細胞可以作為OC前體細胞通過RNAKL機制分化成為具有骨吸收活性的成熟的OC；假膜組織中的FLSCs通過表達RAN

8、KL以及TNFα支持OC的分化并支持OC的骨吸收活性；、Paget’s病以及Paget’s骨肉瘤病灶中的FLSCs通過表達RANKL支持OC形成。 第二部分溶骨性病變中破骨細胞的局部調(diào)控 目的:人工假體無菌性松動、Paget’s病以及骨腫瘤等疾患都存在明顯的局灶性溶骨性病變；作為骨吸收的效應(yīng)細胞的破骨細胞(osteoclast, OC)的分化、活性的調(diào)節(jié)的失衡是局灶性骨溶解的關(guān)鍵。本實驗擬通過體外實驗，探討上述疾患中OC

9、分化及其骨吸收活性的局部調(diào)控。 方法:分別取類無菌性松動的人工假體周圍假膜組織、Paget’s病及Paget’s骨肉瘤病灶標本，利用酶消化法、組織塊培養(yǎng)法以及免疫磁珠法分離組織內(nèi)巨噬細胞以及成纖維母細胞樣基質(zhì)細胞（Fibroblast-like stromal cells, FLSCs）。向巨噬細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中分別加入M-CSF、RANKL和TNFα，于培養(yǎng)結(jié)束后檢測TRAP+、VNR+多核細胞的形成以及象牙磨片上蟲噬樣骨吸

10、收陷窩的形成；將各種組織來源的FLSCs體外培養(yǎng)并傳代后，部分細胞用于RT-PCR檢測RANKL及TNFα mRNA的表達，另一部分細胞與人PBMCs共同培養(yǎng)，分別建立接觸性同培養(yǎng)系統(tǒng)和非接觸性共培養(yǎng)系統(tǒng)，并分別加入RANKL的拮抗劑以及抗TNFα中和抗體，觀察TRAP+、VNR+多核細胞的形成以及蟲噬樣骨吸收陷窩的形成。 結(jié)果：⑴、在M-CSF存在的條件下向培養(yǎng)系統(tǒng)中單獨加入TNFα或者LIGHT，RAW264.7細胞、小鼠

11、及人PBMCs體外培養(yǎng)形成大量TRAP以及VNR陽性的多核細胞（Multi-nucleated cells, MNCs），這些細胞肌動蛋白環(huán)(F-actin ring)染色陽性；掃描電鏡及光學(xué)顯微鏡觀察，在上述培養(yǎng)條件下象牙磨片上見到蟲噬樣骨吸收陷窩。⑵、RANKL拮抗劑OPG未能抑制TNFα、或者LIGHT誘導(dǎo)的TRAP+、VNR+多核細胞的形成以及蟲噬樣骨吸收陷窩的形成；而抗TNFα受體I和II的中和抗體完全阻斷TNFα誘導(dǎo)的TRA

12、P+、VNR+多核細胞形成，DcR3、抗TNFα受體II的中和抗體則抑制LIGHT誘導(dǎo)的TRAP+、VNR+多核細胞的形成。⑶、在M-CSF存在的條件下，同時加入小劑量的RANKL和LIGHT，象牙磨片上骨吸收陷窩的面積比單獨加入同等劑量的RANKL或LIGHT時的面積顯著增多。 結(jié)論：TNFα和LIGHT均能夠不依賴于RANKL而直接誘導(dǎo)OC的分化并支持OC的骨吸收活性。LIGHT對RANKL誘導(dǎo)的OC介導(dǎo)的骨吸收具有協(xié)同作