拉伸應變作用下成骨細胞對破骨細胞分化與凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　骨骼是機體中重要的承重組織,力學刺激下的骨組織主要通過動態(tài)的骨重建過程來調節(jié)其新陳代謝,從而適應新的力學環(huán)境。骨重建過程是人類進化的一種重要的生理反應,可以減少骨組織中骨量的流失,并保證骨組織結構的完整性。骨重建過程受到機體中多種因素的調控,如遺傳因素、激素水平、代謝環(huán)境及力學刺激等。大量的研究表明,力學載荷在骨重建過程中發(fā)揮了重要作用:生理性動態(tài)載荷可以促進骨組織形成,而缺乏這種力學刺激會導致骨量的大量流失

2、,如廢用性骨質疏松等。成骨細胞和破骨細胞是力學環(huán)境下骨重建過程中的關鍵效應細胞,其中成骨細胞主要活性為促進骨形成,而破骨細胞主要活性為促進骨吸收。在不同的力學加載條件下,成骨細胞和破骨細胞均可直接感受力學信號,并轉化為不同的生物學信號,導致骨重建過程向骨形成或骨吸收方向發(fā)展,從而引起骨量的重新分配和骨結構的重新排布。
　　目前認為,骨組織的力學生物學效應主要通過骨重建過程中成骨細胞與破骨細胞間的功能轉化來進行調節(jié),但關于力學載荷下

3、成骨細胞與破骨細胞間的相互作用及其調控機制尚不清楚。因此,本研究通過建立成骨細胞與破骨細胞的體外共培養(yǎng)體系,觀察不同加載強度的拉伸應變作用下,成骨細胞對破骨細胞分化與凋亡的影響,并探討力學載荷下成骨細胞調控破骨細胞分化、凋亡的作用機制。
　　研究內容與方法：
　　(1)建立成骨細胞與破骨細胞的體外共培養(yǎng)體系。
　　采用MC3T3-E1成骨樣細胞株與RAW264.7破骨前體細胞株,經10-8mol/L的1α,25(OH)

4、2維生素D3(1α,25(OH)2D3)及50ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)作用,進行體外成骨細胞與破骨細胞的誘導分化,并利用Transwell小室(口部直徑2.4cm、底部面積4.67cm2、底膜為0.4μm孔徑的聚酯半透膜)建立成骨細胞與破骨細胞的共培養(yǎng)體系。共培養(yǎng)6d后,通過細胞活性(MTT)實驗、堿性磷酸酶(ALP)活力測定及蘇木素-伊紅(HE)染色鑒定共育體系中成骨細胞的增殖和分化活性;通過抗酒石酸酸性磷酸酶(

5、TRAP)染色、甲苯胺藍(TB)染色、TRAP活性測定及掃描電鏡技術(SEM)鑒定共育體系中破骨細胞的分化活性及骨吸收功能。
　　(2)基底拉伸應變對成骨細胞增殖與分化的影響。
　　采用四點彎曲力學加載裝置,對共育體系中成骨細胞施加拉伸刺激,加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d,根據不同的加載強度將培養(yǎng)細胞分為0με、2500με、5000με三組,通過成骨細胞的MTT細胞活性實驗、ALP活性測定及ALP染色觀察不同加載

6、強度的拉伸應變對成骨細胞的增殖與分化活性的影響。
　　(3)拉伸應變作用下成骨細胞對破骨細胞分化的影響及其調控機制。
　　采用四點彎曲力學加載裝置,對共育體系中成骨細胞施加拉伸刺激,加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d,根據不同的加載強度將培養(yǎng)細胞分為0με、2500με、5000με三組,通過破骨細胞的HE染色、TRAP染色、TB染色及TRAP活性測定,觀察不同加載強度的拉伸應變作用下成骨細胞對破骨細胞分化活性的調控作

7、用;通過骨板中骨吸收陷窩的檢測(TB染色)及破骨細胞中組織蛋白酶-K(Cath-k)及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的活性測定(免疫化學染色、ELISA法),觀察不同加載強度的拉伸應變作用下成骨細胞對破骨細胞骨吸收功能的影響。
　　采用四點彎曲力學加載裝置,對共育體系中成骨細胞施加拉伸刺激,加載條件為0.5HZ、1h/天、連續(xù)3d,根據不同的加載強度將培養(yǎng)細胞分為0με、2500με、5000με三組,通過RT-PCR、West

8、ern blot及免疫化學染色方法,檢測不同加載強度的拉伸應變作用下成骨細胞RANKL、OPG及EphA2的表達情況,同時觀察破骨細胞中EphA2的表達及NF-κB通路中信號分子p65的磷酸化水平,探討不同加載強度的拉伸應變作用下成骨細胞調控破骨細胞分化及骨吸收功能的分子機制。
　　(4)拉伸應變作用下成骨細胞對破骨細胞凋亡的影響及其調控機制。
　　采用四點彎曲力學加載裝置,對共育體系中成骨細胞施加拉伸刺激,加載條件為0.5

9、HZ、1h/天、連續(xù)3d,根據不同的加載強度及RANKL干預因子將培養(yǎng)細胞分為0με、2500με、2500με+RANKL、5000με、5000με+RANKL五組。通過流式細胞術,檢測各實驗組中破骨細胞的細胞凋亡率;通過Hoechst染色,觀察各實驗組中破骨細胞的凋亡形態(tài)學變化;通過Westernblot技術,檢測各實驗組中破骨細胞Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達情況,觀察不同加載強度的拉伸應變

10、作用下成骨細胞調控破骨細胞凋亡的分子機制。
　　研究結果：
　　(1)成骨細胞與破骨細胞體外共育體系的建立。
　　與單培養(yǎng)組比較,共培養(yǎng)組成骨細胞在MTT實驗中的吸光度顯著下降(P<0.01);共培養(yǎng)組成骨細胞ALP活性顯著升高(P<0.01);HE染色后,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組成骨細胞無限增殖速度減慢,細胞數(shù)量減少。與單培養(yǎng)組比較,共培養(yǎng)組破骨細胞TRAP活性顯著升高(P<0.01),TRAP染色明顯增強;共培養(yǎng)組可見多個成熟

11、的破骨細胞,細胞體積增大,胞漿伸展、空泡化,并有多個細胞核;共培養(yǎng)組骨片上可見多個圓形的骨吸收陷窩,凹陷明顯,與周邊骨組織界限清楚。此結果顯示,共育體系中成骨細胞與破骨細胞的分化活性均明顯增強。
　　(2)基底拉伸應變對成骨細胞增殖與分化的影響。
　　對成骨細胞施加基底拉伸應變3d后,與0με組比較,2500με組可顯著提高成骨細胞的增殖活性,表現(xiàn)為MTT實驗中OD值顯著升高(P<0.05),2500με組可促進成骨細胞AL

12、P活性的升高(P<0.05);而5000με組則降低成骨細胞的增殖活性(P<0.05)與ALP活性(P<0.05);各實驗組中成骨細胞ALP染色結果與ALP定量分析結果一致。此結果顯示,生理性拉伸應變可促進成骨細胞的增殖與分化,而超生理性拉伸應變則抑制成骨細胞的增殖與分化。
　　(3)拉伸應變作用下成骨細胞對破骨細胞分化的影響及其調控機制。
　　對成骨細胞施加拉伸應變3d后,與0με組比較,2500με組可顯著抑制破骨細胞的

13、分化和骨吸收功能,表現(xiàn)為多核破骨細胞的數(shù)量減少,TRAP活性降低(P<0.05),TRAP染色強度下降(P<0.01),骨片中骨吸收陷窩的面積減小(P<0.01),破骨細胞中Cath-k及MMP-9的表達降低(P<0.05或P<0.01);5000με組中破骨細胞的TRAP活性、骨吸收陷窩面積及Cath-k、MMP-9的表達也顯著下降(P<0.01)。此結果顯示,拉伸應變作用成骨細胞后,抑制了破骨細胞的分化與骨吸收功能。
　　對成

14、骨細胞施加拉伸應變3d后,與0με組比較,2500με組可顯著升高成骨細胞中OPGmRNA及蛋白表達水平(P<0.01),而對RANKLmRNA及蛋白表達無顯著影響,由于OPG的高表達,2500με組可顯著上調成骨細胞中OPG/RANKL表達的比值(P<0.01);與0με組比較,5000με組可顯著升高成骨細胞中OPGmRNA及蛋白表達水平(P<0.05),同時升高RANKLmRNA及蛋白表達水平(P<0.05),且上調成骨細胞中OP

15、G/RANKL表達的比值(P<0.05);與0με組比較,2500με及5000με組對成骨細胞中EphA2的表達均無顯著影響。此結果顯示,拉伸應變作用成骨細胞后,對破骨細胞的抑制作用與上調成骨細胞OPG/RANKL表達的比值有關。
　　對成骨細胞施加拉伸應變3d后,與0με組比較,2500με組可降低破骨細胞中p65磷酸化蛋白(p-p65)的表達(P<0.05),且OPG重組因子干預后可進一步抑制p-p65的表達(P<0.01)

16、,并降低TRAP活性(P<0.01);與0με組比較,2500με及5000με組對破骨細胞中EphA2的表達均無顯著影響。此結果顯示,拉伸應變作用成骨細胞后,對破骨細胞的抑制作用與下調破骨細胞中p65的磷酸化水平有關。
　　(4)拉伸應變作用下成骨細胞對破骨細胞凋亡的影響及其調控機制。
　　對成骨細胞施加拉伸應變3d后,與0με組比較,2500με組可升高破骨細胞的凋亡率(P<0.01);與2500με組比較,2500με

17、+RANKL組則降低破骨細胞的凋亡率(P<0.05);與0με組比較,5000με組可升高破骨細胞的凋亡率(P<0.01);與5000με組比較,5000με+RANKL組則降低破骨細胞的凋亡率(P<0.01);各組破骨細胞的凋亡形態(tài)學變化與凋亡率的檢測結果一致。此結果顯示,拉伸應變作用成骨細胞后,促進了破骨細胞的凋亡發(fā)生,RANKL因子干預后可抑制破骨細胞的凋亡。
　　對成骨細胞施加拉伸應變3d后,與0με組比較,2500με組

18、可顯著促進破骨細胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(P<0.01);與2500με組比較,2500με+RANKL組則顯著抑制破骨細胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(P<0.05或P<0.01);與0με組比較,5000με組可顯著促進破骨細胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(P<0.01);與5000με組比較,5000

19、με+RANKL組則顯著抑制破骨細胞中Fas、FasL、Casepase-8及Caspase-3蛋白的表達(P<0.05或P<0.01)。此結果顯示,拉伸應變作用成骨細胞后,對破骨細胞的促凋亡機制與激活破骨細胞中Fas/FasL介導的細胞凋亡通路有關。
　　研究結論：
　　(1)Transwell共育體系中成骨樣細胞的無限增殖能力減弱,而分化活性增強,同時破骨前體細胞被誘導分化為成熟的破骨細胞,并具有骨吸收功能。該共育體系可

20、用于探討力學環(huán)境下骨重建中成骨細胞與破骨細胞間信號調控機制的實驗研究。
　　(2)生理性拉伸應變(2500με)可促進成骨細胞的增殖和分化,繼而抑制共育體系中破骨細胞的分化及骨吸收功能,而超生理性拉伸應變(5000με)則抑制成骨細胞的增殖和分化,同時抑制共育體系中破骨細胞的分化及骨吸收功能。不同加載強度的拉伸應變作用下,成骨細胞抑制共育體系中破骨細胞分化及骨吸收功能的作用機制,可能與上調成骨細胞中OPG/RANKL表達的比值,繼