拉伸應(yīng)變對破骨細胞凋亡的影響及其作用機制的研究.pdf

1、研究背景和目的
　　骨是人體重要的承重和運動器官,骨組織始終處于外界力學(xué)環(huán)境中。骨既能承受外界力學(xué)載荷,又能隨著外界力學(xué)載荷的變化改變自身的形態(tài)和功能。骨重建是成熟骨組織的一種重要替換機制。力學(xué)載荷是通過骨重建過程對骨的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。生理狀態(tài)下,骨吸收和骨形成之間形成一種動態(tài)平衡,骨在功能需要的地方發(fā)生骨形成,在不需要的地方發(fā)生骨吸收。骨重建過程包括了破骨細胞的破骨作用和成骨細胞的成骨作用。破骨細胞是來源于骨髓造血干細胞

2、從單核巨噬細胞系早期的分化過程中分支出來。破骨細胞是骨重建的過程的直接參與者,并在骨重建的起始階段起到關(guān)鍵作用。破骨細胞的活性變化和凋亡變化都會對骨重建過程有重要影響。但是,力學(xué)載荷是否對破骨細胞凋亡起作用目前尚不清楚。
　　本研究試圖通過細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法來研究基底拉伸應(yīng)變對破骨細胞凋亡的影響,并初步探索基底拉伸應(yīng)變對破骨細胞凋亡影響的作用機制。
　　研究內(nèi)容
　　(1)破骨細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定。
　

3、　(2)基底拉伸應(yīng)變對破骨細胞凋亡的影響的研究。
　　(3)基底拉伸應(yīng)變對破骨細胞凋亡影響的機制的初步研究。
　　研究方法
　　(1)利用來自小鼠的破骨前體細胞株RAW264.7細胞,采用含有兩種細胞因子濃度為50ng/mL的小鼠重組可溶性核因子кB受體活化因子配基(receptoractivatorofNF-кBligand,RANKL)和50ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-colonysti

4、mulatingfactor,M-CSF)的DMEM(Dulbeccominimumessentialmedium)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)培養(yǎng)實驗用的成熟破骨細胞。利用多種方法鑒定誘導(dǎo)的細胞是否具有成熟破骨細胞活性:首先采用光學(xué)顯微鏡下直接觀察和TRAP染色后觀察誘導(dǎo)的破骨細胞,又采用了甲苯胺藍染色和掃描電子顯微鏡觀察破骨細胞形成的骨吸收陷窩的方法鑒定破骨細胞。
　　(2)對破骨細胞施加生理強度2500με和病理強度5000με的基底拉伸應(yīng)

5、變,加載條件采用連續(xù)3d,1次/d,每次1h,加載頻率為0.5HZ。檢測拉伸應(yīng)變是否對破骨細胞凋亡有影響:對加載后的破骨細胞采用hoechst染色,Annexin結(jié)合實驗,caspase-3活性測定實驗等方法檢測破骨細胞的凋亡情況。
　　(3)對破骨細胞施加生理強度2500με和病理強度5000με的基底拉伸應(yīng)變,加載條件采用1次/d,每次1h,連續(xù)3d,加載頻率為0.5HZ。檢測線粒體通路是否參與拉伸應(yīng)變對破骨細胞凋亡的調(diào)節(jié)中:

6、對加載后的破骨細胞進行JC-1染色,采用線粒體膜電位測定實驗測定線粒體膜電位,免疫印跡實驗測定破骨細胞Bcl-2、caspase-3的表達和細胞色素C的釋放。
　　研究結(jié)果
　　(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后,光學(xué)顯微鏡下有體積增大的多核細胞出現(xiàn),形態(tài)不規(guī)則并且邊緣模糊。誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后,多核細胞體積進一步增大,數(shù)量增多?？咕剖崴嵝粤姿崦?TRAP)染色多核巨細胞的胞核呈藍色,胞質(zhì)特異性染色呈紅色。
　　骨片骨吸收陷窩甲苯胺藍染

7、色結(jié)果顯示,骨片上有邊緣清晰的骨吸收陷窩形成,有骨吸收陷窩處因染料填入而呈甲苯胺藍濃染的藍紫色。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示薄骨片上有明顯的骨吸收陷窩形成,邊緣清晰,內(nèi)部凹陷且底面凹凸不平。
　　(2)對破骨細胞施加基底拉伸應(yīng)變3d后,hoechst染色結(jié)果顯示,兩組加載組細胞和一組對照組細胞均有細胞凋亡發(fā)生,其中凋亡的多核破骨細胞呈現(xiàn)藍色致密濃染的胞核。計數(shù)后得出三組破骨細胞的凋亡率,對照組破骨細胞的凋亡率為21.45％±0.99

8、%,2500με載荷加載組破骨細胞的凋亡率為15.34%±1.50%,與對照組相比顯著下降(p<0.05),5000με載荷加載組破骨細胞的凋亡率為21.95%±1.06%,與對照組相比無顯著差異(p>0.05)。
　　Annexin結(jié)合實驗的結(jié)果顯示,對照組破骨細胞的早期凋亡率為11.80%,2500με載荷加載組破骨細胞的早期凋亡率為7.54%,與對照組相比顯著下降,5000με載荷加載組破骨細胞的凋亡率為10.30%,與對照

9、組相比下降并不明顯。
　　最后,caspase-3活性測定實驗結(jié)果顯示,2500με載荷加載組相對對照組的caspase-3活性為0.7046±0.0148,與對照組相比顯著下降(p<0.05),5000με載荷加載組相對對照組的caspase-3活性為1.1244±0.0602,與對照組相比稍有上升(p<0.05)。
　　(3)對破骨細胞施加基底拉伸應(yīng)變3d后發(fā)現(xiàn),線粒體膜電位測定實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,2500με載

10、荷加載組破骨細胞的線粒體膜電位顯著增高(p<0.05),表明破骨細胞線粒體膜的去極化過程被阻止,5000με載荷加載組破骨細胞的線粒體膜電位與對照組相比無明顯差異(p>0.05)。
　　免疫印跡實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,2500με載荷加載組破骨細胞的Bcl-2表達明顯大幅度增高(p<0.05),5000με載荷加載組破骨細胞的Bcl-2表達同樣增高(p<0.05),但幅度并不沒有2500με載荷加載組的那么大。同時,與對照組相

11、比,2500με載荷加載組破骨細胞的胞漿細胞色素C含量顯著減少(p<0.05),暗示細胞色素C的釋放被抑制,而5000με載荷加載組破骨細胞的胞漿細胞色素C含量與對照組相比并無明顯變化(p>0.05)。最后,2500με載荷加載組破骨細胞的caspase-3表達顯著減少(p<0.05),而5000με載荷加載組破骨細胞的caspase-3表達與對照組相比并無明顯變化(p>0.05)。
　　結(jié)論
　　(1)小鼠單核/巨噬細胞系

12、RAW264.7細胞在含有50ng/mL的RANKL和50ng/mL的M-CSF的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)下,可以分化出具有典型生物學(xué)活性的成熟破骨細胞。
　　(2)拉伸應(yīng)變的加載能夠影響破骨細胞的凋亡。目前為止,未見此類相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn),對破骨細胞施加2500με的四點彎曲基底拉伸應(yīng)變能夠明顯抑制破骨細胞的凋亡,而5000με的加載對破骨細胞凋亡的影響并不明顯。
　　(3)線粒體通路參與到破骨細胞凋亡的力學(xué)響應(yīng)過程中。同樣,